华支睾吸虫胞浆苹果酸脱氢酶活性位点氨基酸点突变对酶活性和热稳定性影响

目的为了研究华支睾吸虫胞浆苹果酸脱氢酶H195及其周围氨基酸的点突变对酶活性和热稳定性的影响,进一步了解蛋白分子结构与功能的关系。方法利用PCR技术,对胞浆苹果酸脱氢酶H195及其周围氨基酸基因进行点突变,与pQE30质粒连接构建重组质粒,转染大肠杆菌后表达蛋白,测定酶活性和圆二色性,测定不同温度时222nm圆二色性改变,确定不同点突变蛋白的热稳定性。结果H195被异亮氨酸、半胱氨酸和酪氨酸置换后,酶活性下降了100倍以上,但随着H195被不同氨基酸置换和H195周围氨基酸被置换情况的不同,不同突变株表达的蛋白酶活性差别很大,H195/I195和H195/Y195突变株表达的蛋白酶活性明显高于H195N197/I195Y197和H195T198/C195M198突变株表达的蛋白酶活性;H195/Y195突变株表达的蛋白与未突变蛋白的二级结构差异明显;H195/Y195和H195T198/C195M198突变株表达的蛋白热稳定性明显降低,tm值分别为63.5℃和64℃,比Cs cMDH的tm值分别下降了4℃和3.5℃。结论活性中心H195的点突变可导致华支睾吸虫胞浆苹果酸脱氢酶活性的明显下降,而且H195被不同的氨基酸置换后可导致酶活性下降程度的不同,H195周围氨基酸被替换成具有形成氢键或二硫键的氨基酸后,导致酶活性下降更为明显;H195及其周围氨基酸的突变可导致蛋白质二级结构的改变和热稳定性的不同程度下降。     

恶性疟原虫FCC1/HN(CQS)株Pfmdr1、Cg1基因T-A克隆及序列分析

目的　将恶性疟原虫FCC1/HN株 (CQS)Pfmdr1和Cg1全基因编码区克隆入测序载体 ,测定其序列 ,为以后研究其与疟原虫耐药性的关系奠定基础。方法　利用PCR扩增技术 ,分 3个片段从恶性疟原虫FCC1/HN株基因组DNA中 ,特异扩增Pfmdr1全基因编码序列 ;分 2个片段特异扩增Cg1全基因编码序列。扩增产物经纯化回收后 ,T -A克隆入测序载体 pMD18-T ,转化大肠杆菌 (E coli)JM 10 9,筛选阳性克隆 ,并进行双酶切及PCR扩增鉴定 ,获得阳性重组质粒 ,用Sanger双脱氧链终止法进行DNA测定。结果　CQSFCC1/HN株Pfmdr1基因序列与CQSFc2 7株同源性高 ,全长 4 2 4 8bp ,编码 14 15个氨基酸 ;测得Cg1基因全长为 2 82 0bp ,编码 939个氨基酸 ,存在串联α重复序列。 结论　恶性疟原虫FCC1/HN(CQS)株Pfmdr1和Cg1全基因编码序列的测定 ,为以后研究耐药性虫株的上述基因以及它们与疟原虫耐药性的关系奠定基础。     

日本血吸虫(中国大陆株)Sj16基因真核表达载体的构建及序列分析

目的为了进一步研究日本血吸虫(中国大陆株)Sj16的免疫调节功能,丰富有关血吸虫免疫逃避知识.方法根据曼氏血吸虫Sm1 6基因已知序列设计合成一对引物,用PCR技术从日本血吸虫(中国大陆株)成虫cDNA文库中扩增Sj16基因;将Sj16基因定向克隆入pcDNA3,转化感受态DH5a菌;用酶切、PCR扩增鉴定筛选得到的重组阳性克隆.以重组pcDNA3-Sj16质粒为模板,用双脱氧链末端终止法测定Sj16基因序列,应用软件辅助分析Sj16序列及进行Sj16与曼氏血吸虫的Sm16同源性比较.结果从日本血吸虫(中国大陆株)成虫cDNA文库中获取Sj16基因,重组质粒中含有Sj16基因,成功构建日本血吸虫(中国大陆株)Sj16基因真核表达重组质粒pcDNA3-Sj16;Sj16基因开放读码框有354碱基,编码¨7氨基酸,N端18个氨基酸可能为信号肽序列;Sj16与Sm16有高度同源性,只存在一个氨基酸的差异.结论成功克隆了Sj16基因的真核表达载体,并测定、分析了Sj16基因序列,为深入研究Sj16的免疫调节功能,丰富有关血吸虫免疫逃避知识打下基础.     

米诺环素联合化瘀祛斑胶囊治疗玫瑰痤疮的疗效观察

 目的 观察盐酸米诺环素和化瘀祛斑胶囊联合用药治疗玫瑰痤疮的临床疗效。方法 将100例玫瑰痤疮患者随机分为治疗组和对照组,分别给予盐酸米诺环素联用化瘀祛斑胶囊和盐酸米诺环素胶囊单用治疗,两者疗程6周。结果 治疗组有效率86%,对照组有效率为68%;两组比较差异具有统计学意义(P<0.01),治疗组改善程度明显优于对照组。结论 米诺环素联合化瘀祛斑胶囊治疗玫瑰痤疮安全性高,效果更好。     

小鼠β2m基因打靶载体的构建及序列分析

目的 采用分子生物学技术，构建小鼠β2m基因打靶载体，为进一步进行胚胎干细胞基因敲除、建立β2m基因缺陷型干细胞奠定基础。方法 通过设计和合成引物，经PCR从小鼠β2m-pSV2ΔHXgpt基因组克隆分别扩增小鼠β2m的4.2kb和0.8kb片段作为同源臂，将其分别插入载体pPNT的neo基因两侧，构建小鼠β2m基因替换型打靶载体pPNT-β2m。结果 经过PCR、限制性酶酶切鉴定，以及DNA序列分析，证实此两条同源臂为包含小鼠β2m前三个外显子在内的基因片段，证明载体构建成功。结论 PCR法构建基因打靶载体是新颖、简便而可靠的方法。     

生物信息学及在寄生虫学上的应用

人类基因组计划及模式生物基因组研究产生了大量的基因组信息,对如此巨大且具有高度复杂性的生物数据的管理和分析产生了生物信息学这门新的学科,生物信息学的主要研究对象是DNA及RNA序列和蛋白质序列。本文重点介绍了生物信息学的概念,研究对象,研究内容,研究方法及其在寄生虫学上的应用。     

利用RT—PCR的方法检测恶性疟原虫海南株FCC1／HN CT基因在红细胞内期的表达及CTP基因真核表达载体的构建

目的 利用反转录PCR（RT-PCR）的方法检测CTP基因是否在恶性疟原虫红内期表达。并构建CTP因的真核表达载体,以便进一步研究其功能。方法 按常规方法体外培养红内期恶性疟原虫,用Trizol试剂提取红内期疟原虫总RNA,通过RT-PCR方法扩增恶性疟原虫FCC1/HN株CTP编码基因并构建CTP基因的真核表达载体。结果获得了恶性疟原虫CTPcDNA的全编码区序列并将其克隆入真核表达载体pcDNA3。结论 CTP基因在恶性疟原虫FCC1/HN株红细胞内期表达并成功地构建了CTP基因的重组表达质粒。     

寄生虫IgE依赖组胺释放因子抗体抑制致敏肥大细胞释放组胺作用的研究

目的 观察抗寄生虫IgE依赖组胺释放因子(HRF)抗体对重组大鼠IgE依赖组胺释放因子(rRHRF)诱导致敏吧大细胞释放组胺功能的影响.方法 用纯化的日本血吸虫和华支睾吸虫IgE依赖组胺释放因子重组蛋白rSjHRr和rCsHRF分别免疫大鼠,分离免疫血清并通过亲和层析纯化出总IgG.将rRHRF(终浓度为75 μg/mL)分别与2种纯化抗体(浓度梯度为3/5,2/5,1/5,0)37℃预先反应30 min后,再加入卵清蛋白变应原致敏的大鼠肺肥大细胞,利用荧光分光光度法测定rRHRF诱导吧大细胞组胺释放量.实验中采用未致敏大鼠血清纯化所得总IgG作为对照.结果 得到了纯化的抗rSjHRF IgG和抗rC-sHRF LgG,抗rCsHRF IgG和抗rSjHRF IgG可明显抑制大鼠内源性IgE依赖HRF诱导致敏肥大细胞释放组胺的功能,但抗体抑制作用的强弱与抗体浓度之间的剂量依赖关系还需进一步实验验证.结论 抗寄生虫IgE依赖组胺释放因子抗体具有抑制大鼠IgE依赖组胺释放因子诱导致敏肥大细胞释放组胺的作用,可能是参与寄生虫感染抑制宿主Ⅰ型超敏反应发生的免疫学机制之一,为预防和控制Ⅰ型超敏反应提供了新的思路.     

SARS-CoV E蛋白基因的扩增及原核表达载体的构建

加拿大英属哥伦比亚癌症研究所基因组科学中心已完成了SARS冠状病毒的全基因组测序 (基因库登录号 :AY2 74 119)。SARS CoV基因组编码包括S蛋白、M蛋白、N蛋白和E蛋白等结构蛋白质。E蛋白是最小的结构蛋白 (为糖蛋白 ) ,散布于SARS病毒的包膜 ,疏水性最强 ,其核苷酸序列为 2 31bp ,编码 76个氨基酸 ,其等电点为 6 .0 1,相对分子质量为 8.36 1× 10 3。推测E蛋白的作用有利于病毒形状的形成 ,在病毒颗粒形成过程中起主要作用。本文利用已公布的SARS CoV基因组序列 ,克隆了E蛋白基因 ,以期为深入研究E蛋白的生物学功能和药物或疫…     

牛带绦虫亚洲亚种乳酸脱氢酶基因的克隆表达及免疫原性分析

目的 对牛带绦虫亚洲亚种成虫乳酸脱氢酶基因（LDH）进行克隆、表达和免疫原性分析。 方法 将牛带绦虫亚洲亚种成虫TaLDH克隆到原核表达质粒pET-30a（+）中,在大肠埃希菌BL-21/DE3中用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达,表达产物通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）进行鉴定,用镍离子金属螯合剂亲和层析柱进行纯化,纯化的重组蛋白pET-30a（+）-TaLDH用蛋白质印迹（Western blotting）分析其免疫原性。 结果 PCR、双酶切及DNA测序结果均显示重组质粒pET-30a（+）-TaLDH构建成功。SDS-PAGE结果表明,目的基因在大肠埃希菌BL-21/DE3中获得高效表达,经亲和层析获得了高纯度蛋白,浓度为0.9 mg/ml。Western blotting分析结果显示,重组蛋白pET-30a（+）-TaLDH能识别感染牛带绦虫亚洲亚种的猪血清和患者血清,在相对分子质量(Mr)35 000处有一清晰条带,表明其具有免疫反应性。 结论 牛带绦虫亚洲亚种成虫乳酸脱氢酶基因可在原核表达系统中获得具有免疫学活性的高效表达。