抗HIF-1tx肺腺癌人源单链抗体的筛选和初步鉴定

目的 从单链大容量噬菌体抗体库中筛选特异性的抗HIF-lα肺腺癌人源单链抗体(scFv),并进行初步鉴定.方法 先后以肺腺癌细胞A549、HIF-1α为抗原,通过"吸附-洗脱-扩增"从大容量噬菌体抗体库中筛选特异性抗体.感染大肠杆菌HB2151,实现可溶性抗体的表达,ELISA、免疫细胞化学检测抗原-抗体结合活性,SDS-PAGE和Western blot检测可溶性抗体表达和相对分子质量.结果 经筛选后,单链抗体得到富集.随机选取10个克隆,ELISA检测5个与HIF-lα抗原呈阳性反应,阳性率为50%.免疫细胞化学表明抗体与A549细胞特异性结合.SDS-PAGE、Western blot证明单链抗体成功可溶表达,且相对分子质量在30×10~3左右,ELISA显示其有较好的特异性.结论 利用单链大容量噬菌体抗体库技术成功获得特异性抗HIF-1α的肺腺癌人源单链抗体.     

X射线诱导肝癌多药耐药细胞模型生物学特性的实验研究

目前，药物介入性治疗是肝癌的重要临床处理手段，但肿瘤细胞多药耐药（MDR）严重限制了疗效。因此研究肝癌MDR细胞生物学特性，能够为肿瘤MDR逆转方法的探讨提供理论依据，对于改善肝癌的治疗有着积极意义。本实验采用X射线诱导建立人肝癌HepG2耐药细胞模型并对其生物学特性进行研究。[第一段]     

食管癌人源噬菌体单链抗体库的构建与初步筛选

目的构建全人源化食管癌噬菌体单链抗体库,从中筛选Eca-109细胞特异性单链抗体。方法取食管癌病人癌肿周围淋巴结作为B细胞的来源,提取总RNA,用RT-PCR的方法获得抗体可变区基因cDNA文库。首先分别网格筛选确定扩增VH和VL基因片段的引物对,以cDNA为模板扩增VH和VL基因片段,再以它们为模板分别扩增VH-linker与VL-linker,用SOE-PCR技术将后者组装成scFv,再引入酶切位点SfiI和NotI。将scFv基因克隆入噬菌粒载体pCANTAB-5E后电转入EcoliTG1,经抗体表达的辅助噬菌体M13KO7超感染,构建单链抗体库。PCR鉴定阳性重组菌EcoliTG1中scFv的插入率,1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定SfiI和NotI双酶切质粒的结果。从该抗体库中筛选特异性识别Eca109细胞的单链抗体,将阳性克隆菌转化EcoliHB2151进行可溶性表达。抗体亲和层析纯化后经SDS-PAGE、West-ern blot鉴定,通过ELISA法、免疫组化法、免疫细胞化学鉴定其与人食管癌细胞的结合的特异性。结果食管癌周围淋巴结总RNA的提取琼脂糖电泳结果中可见清晰的28S、18S条带;VH基因的大小约为450bp,VL基因为350bp,组装后的scFv基因约为850bp。用pUC18标准质粒测定转化效率达到108cfu.μg-1。scFv的阳性插入率为91.7%(22/24)。在筛选过程中,食管癌噬菌体单链抗体得到富集,收获率逐轮得到提高,第4轮为第1轮的141倍;SDS-PAGE与Western blot结果显示抗体分子量为30ku左右,在Ecoli HB2151中实现了单链抗体的可溶性表达。免疫组织化学结果提示可溶性抗体仅食管癌组织着色,而肝癌、胃癌组织不染色。免疫细胞化学结果表明此可溶性抗体可使食管癌细胞Eca109染色。细胞ELISA测定结果显示可溶性抗体具有较高的特异性,能与Eca109细胞结合,而不与胃癌BGC-823和NHEEC结合。结论从食管癌病人癌肿周围淋巴结成功地构建人源食管癌噬菌体单链抗体库,并从中筛选到食管癌特异性抗体。     

T细胞因子4的选择性剪接与肿瘤

TCF4属核内转录因子,在Wnt/β-catenin信号途径中可调控下游基因表达。TCF4有着分子(开关)的双重作用,可表现为转录激活或转录抑制的作用,影响一系列基因的表达,在胚胎的发育及肿瘤的发生发展中起重要的作用。TCF4在转录后加工过程中存在选择性剪接,可形成多种mRNA剪接异构体,编码产生不同功能结构域的蛋白,进而对下游多种基因的转录进行活性调节。TCF4及其剪接异构体的异常调控与肿瘤的发生发展密切相关。     

MicroRNA家族在结直肠癌发生发展过程中的作用

结直肠癌（ Colorectal cancer,CRC）是消化系统的常见恶性肿瘤之一。 MicroRNA家族与CRC的相关基因和通路有着广泛的联系。 MicroRNA家族中有些是促癌基因,有些作为抑癌基因发挥作用,与细胞的各种信号传导通路组成一个复杂的调控网络,随着表达的异常,促进肿瘤的发展。本文综述了MicroRNA家族在结肠癌发生发展过程中的作用。     

彩超对下肢骨折术前深静脉血栓筛查的意义

目的 探讨彩色多普勒超声筛查下肢骨折患者术前深静脉血栓的意义.方法 对580例单侧下肢骨折患者,术前应用彩色多普勒超声对下肢深静脉进行检测,观察有无血栓形成、累及部位、范围和活动度.结果 术前下肢深静脉血栓检出率为11.3％ (66/580),其中小腿肌间静脉血栓占40.9％ (27/66),严重的深静脉血栓(即股静脉至腘或胫后静脉、1例累及髂外静脉)占15.1％ (10/66);超声可显示血栓近端有活动度的8例.结论 下肢骨折患者易发生深静脉血栓,术前行彩色多普勒超声筛查,可早期检出下肢深静脉血栓的部位与活动度,对降低麻醉、手术风险,防止致命性肺栓塞具有重要意义.     

反义寡脱氧核苷酸抑制多药耐药基因mdr1表达并逆转耐药肝癌细胞的体外试验研究

目的:探讨反义寡脱氧核苷酸(ASODN)抑制多药耐药基因(mdr1)对耐阿霉素(ADM)肝癌细胞HepG2/ADM化疗敏感性的影响。方法:以多药耐药基因mdr1人工合成寡脱氧核苷酸(ODN),其中ODN分为ASODN和正义寡脱氧核苷酸(SODN),并采用脂质体转染技术将ODN与HepG2/ADM共培养,试验分为反义寡脱氧核苷酸(mdr1-ASODN)处理组、正义寡脱氧核苷酸(mdr1-SODN)对照组和空白对照组,通过逆转录聚合酶链式反应和蛋白免疫印迹法观察HepG2/ADM细胞中mdr1mRNA及其蛋白表达情况;MTT法观察HepG2/ADM细胞转染mdr1-ASODN前、后对化疗药物(ADM、顺铂、5-氟尿嘧啶)的敏感性。结果:与mdr1-SODN对照组和空白对照组比较,mdr1-ASODN处理组HepG2/AMD细胞中mdr1mRNA及其蛋白表达均明显降低(P<0.05);与转染前比较,HepG2/ADM细胞的增殖抑制率明显增加(P<0.05)。结论:ASODN能有效抑制mdr1基因表达,并恢复肝癌HepG2/ADM细胞对化疗药物的敏感性。     

表皮生长因子受体靶向纳米载体荷载C-erbB2反义寡脱氧核苷酸对人乳腺癌SK-BR3细胞的摄取与滞留

背景:结合肿瘤的分子靶向技术和纳米技术,制备出一种新的具有靶向作用的纳米载体,以达到对肿瘤更好靶向作用的目的.目的:制备表皮生长因了偶联牛血清白蛋白纳米载体,联合核素标记的c-erbB2反义寡脱氧核苷酸,体外观察人乳腺癌SK-BR3细胞对其摄取情况.设计、时间及地点:对比观察实验,于2006-09/2008-03在重庆医科大学生物化学和分子生物学教研窀,重庆医科大学分子医学与肿瘤研究中心,重庆医科大学放射医学教研室完成.材料:生血清白蛋白(生物技术级)由美围Amresco公司提供,表皮生长因子由英国PeproTech EC LTD提供,125Ⅰ由成都中核高通同位素股份有限公司提供.寡脱氧核苷酸由上海生工生物工程技术服务有限公司提供.方法:采用超声乳化-化学交联及羧和反应制备表皮生长因子偶联白蛋白靶向纳米载体,通过核素标记示踪技术检测表皮生长因子偶联白蛋白靶向纳米载体的相关性质.主要观察指标:测量表皮生长因子靶向纳米载体荷载c-erbB2反义寡脱氧核苷酸的载药量、包封率及释药率,人乳腺癌SK-BR3细胞对表皮生长因子靶向纳米载体的摄取率及滞留率.结果:表皮生长因子靶向纳米载体包载125Ⅰ标记的反义寡脱氧核苷酸组的摄取率及滞留率高于正义寡脱氧核苷酸组和无义寡脱氧核昔酸组.同时c-erbB2寡脱氧核苷酸使用纳米载体荷载组的摄取率及滞留率均高于未使用纳米载体组,差异有显著性意义(P<0.05).结论:125Ⅰ标记的表皮生长因子靶向纳米载体能够提高乳腺癌SK-BR3细胞对o-erbB2反义寡脱氧核苷酸的摄取和滞留,能达到更好的靶向作用.     

全人源食管癌噬菌体单链抗体库的筛选及特异性鉴定

目的：我们应用噬菌体抗体库技术构建了食管癌相关的人源单链抗体文库，本文目的在于对该抗体库进行鉴定，筛选食管癌抗体，同时对抗体的活性进行检测。方法：PCR鉴定TG1中食管癌单链抗体scFv的插入率；1．5％琼脂糖凝胶电泳鉴定Sfi I和NotI双酶切质粒的结果；先以人正常食管上皮细胞吸附后再以食管癌细胞Eca109为抗原对所建抗体库进行4轮的亲和筛选；将阳性重组噬菌体克隆感染Ecoli HB2151进行可溶性抗体表达及经亲和柱层析纯化；用SDS—PAGE测定该抗体的相对分子量；用Western blot鉴定该抗体；用ELISA法、免疫组化法鉴定该抗体与人食管癌细胞的结合的特异性。结果：seFv基因插入率为91．7％；酶切后检测到目的基因片段。在亲和筛选过程中，食管癌噬菌体单链抗体得到富集，收获率逐轮得到提高，第4轮为第1轮的141倍；SDS—PAGE与Western blot结果显示抗体的相对分子量为左右和30kd条带染色；在Ecoli HB2151中实现了单链抗体的可溶性表达。免疫组织化学结果提示可溶性抗体仅染食管癌组织，而肝癌组织和胃癌组织不染色。免疫细胞化学结果表明此可溶性抗体可使Eca109细胞染色。ELISA测定结果显示可溶性抗体具有较高的免疫活性，能与Eca109细胞结合，而不与胃癌BGC-823和NHEEC结合。结论：利用噬菌体抗体库技术的阴性、阳性筛选得到了食管癌噬菌体单链抗体，且筛选后的抗体片段与人食管癌细胞有特异性的结合活性。