细胞中DNA含量测定 Ⅰ.改进的二苯胺法

1930年 Dische 报告用二苯胺法测定 DNA,1956年 Burton 加以改进,遂使此法得以被广泛使用。其后虽先后经多人、多次进行修正,灵敏度始终在5～10μg/ml 水平。因此,分析那些得量少或核酸含量低的标本时便不得不用荧光法或 EB 荧光法,据知荧光法灵敏度高于二苯胺法。我室     

重组人甲状旁腺激素相关蛋白1-141序列的克隆和表达载体构建

目的：构建人甲状旁腺激素相关蛋白1-141（hPTHrP1—141）基因的表达载体。方法：提取人基因组DNA，PCR扩增PTHrP1—141基因，将其克隆入原核表达载体pQE-30Xa，构建重组表达载体pQE-30Xa／hPTHrP1—141。结果：重组载体pQE-30Xa／hPTHrP1-141经限制性核酸内切酶Pvu Ⅱ酶切鉴定，得到符合预期大小的核酸片段。结论：表达载体pQE-30Xa／hPTHrP1—141构建成功。     

针刺“风府”穴对大鼠脑内神经肽胆囊收缩素基因表达的影响

手法针刺大鼠“风府”（天门）穴，用ＮｏｒｔｈｅｒｎＢｌｏｔ方法对针刺不同时限的生理状态大鼠脑内神经肽胆囊收缩素（ＣｈｏｌｅｃｙｓｔｏｋｉｎｉｎＣＣＫ）的基因在转录水平的表达情况进行比较研究。结果表明针刺即刻ＣＣＫ信息核糖核酸（ｍＲＮＡ）表达开始增加，３小时其浓度急剧升高．６小时已回落，２４小时几近平复。提示针刺后３～６小时是ＣＣＫ基因表达的高峰时期，手法针刺诱发的脑内ＣＣＫｍＲＮＡ的表达没有观察到累积迭加和持续促进的结果，并且与捉抓引起的应激反应有本质区别。     

人降钙素基因的克隆及其序列分析

目的：克隆人降钙素基因（ｈＣＴ）并经序列分析予以确证。方法：首先自新鲜全血中用含ＴｒｉｔｏｎＸ－１００的缓冲液提取基因组ＤＮＡ，经酒精沉淀和洗涤后，作为模板，加入上下游引物，应用聚合酶链反应直接扩增出ｈＣＴ的编码序列。并将此段ＤＮＡ插入克隆载体ｐＵＣ１８的ＥｃｏＲＩ和ＳｍａＩ位点之间。最后用ＰＣＲ－双脱氧末端终止法进行序列分析。结果：成功地克隆了ｈＣＴ，证实所得ｈＣＴ基因克隆含编码人降钙素３２个氨基酸的全长ＤＮＡ序列９６ｂｐ。结论：已获得人降钙素基因克隆，为后续研究打下基础     

重组人甲状旁腺素相关蛋白PTHrP1-86对骨质疏松大鼠治疗作用的实验研究

目的 探讨重组人甲状旁腺素相关蛋白PTHrP1-86对骨质疏松大鼠的骨同化作用.方法 用摘除大鼠双侧卵巢的方式制备骨质疏松模型(OVX),去势手术16周后,测定大鼠腰椎骨密度,确认动物模型造模成功.实验动物分为8个组,给药后测定骨密度、骨钙素、骨形态计量学、骨生物力学等指标,初步评价重组人甲状旁腺素相关蛋白PTHrP1-86对骨质疏松大鼠的骨同化作用.结果 重组人甲状旁腺素相关蛋白PTHrP1-86可使骨转换加快,促进新骨生成,使骨的力学性能提高,抗弯曲强度提高,抗变形能力增强,韧性增高,脆性降低,不易发生断裂.结论 PTHirPl-86能有效提高骨的抗骨折能力,对治疗和预防骨质疏松有一定疗效.同时证明该动物实验方法行之有效,可以很好地测定PTHrP对骨质疏松的治疗作用,并可以此为依据开始一期临床实验.     

IGF-1信号肽及成熟肽全编码序列的克隆

目的：克隆含信号肽编码序列的胰岛素样生长因子I(IGF-1)基因，为转IGF-1基因研究奠定基础。方法：分别扩增IGF-1信号肽及成熟肽的编码序列，以PCR的方法对二者进行拼接，将拼接后的DNA片段克隆入质粒载体pGEM—Teasy。结果：以PCR拼接的方式成功地扩增出大小为360bp含信号肽编码序列的IGF-1基因。完成了该DNA片段的克隆，经序列测定证实读码框架完全正确。结论：克隆IGF-1信号肽及成熟肽全编码序列，可以为转IGF-1基因研究奠定基础。     

重组人干扰素大肠杆菌高效表达系统的建立

目的:构建重组人干扰素-α2b(rhIFN-α2b)原核表达系统,以获得rhIFN-α2b在大肠杆菌中的高效表达。方法:依据大肠杆菌遗传密码子频率表,在不改变氨基酸组成的情况下,人工半合成适于在大肠杆菌中表达的rhIFN-α2b编码序列;经PCR扩增后,克隆人表达型质粒载体pDH;筛选阳性菌落,温度诱导表达,表达产物行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、蛋白质印迹(WesternBlot)鉴定,并以人羊膜细胞-水泡性口炎病毒(WISH-VSV)系统鉴定rhIFN-α2b抗病毒活性。结果:PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定可见与预期大小符合的512bp的DNA条带;重组质粒pDH/IFN-α2b经序列分析,证实含有与预期相符且读码框架正确的hIFN-2b编码序列;SDS-PAGE可见与IFN-α2b分子质量大小一致的蛋白质条带,WesternBlot鉴定此条带为rhIFN-2b,其比活性达(1.8～2)×108U/mg。结论:rhIFN-α2b在大肠杆菌中的高效表达系统构建成功,且能高水平地表达出具有生物活性的rhIFN-α2b。     

血清游离甲状腺素夹心酶联免疫分析法

将小分子半抗原激素T4与人血清白蛋白缀合而成T4缀合物,使T4由单价变为多价,实现FT4双位夹心免疫酶标检测法,灵敏度比常规酶标免疫方法(EIA)提高近10倍,批内、批间变异和回收率及正常和病理值均可达到临床应用要求.     

缺碘性甲状腺功能低下大鼠骨发育障碍的病理学观察

目的探讨缺碘所致发育期大鼠甲状腺功能(甲功)低下造成的发育障碍,包括成骨细胞分子异常、骨计量学证据和病理学证据等,本文报告病理学观察结果.方法复制了第1代和第2代碘缺乏大鼠动物模型,测定血清中T3、T4水平,拍摄X光片,并作股骨远端骨切片观察骨发育情况.结果 20日龄正常组与缺碘组T3水平分别为(1.83±1.11)nmol/L和(1.66±1.01)nmol/L,补碘后略有下降,差异无显著意义;T4水平分别为(104.68±25.73)nmol/L和(3.47±1.06)nmol/L,显示甲功低下,补碘后升至(119.88±29.45)nmol/L.缺碘大鼠体重在整个发育过程中(1～84 d)始终低于正常组,平均降低了56%;X光片中可见,缺碘大鼠的长骨较同日龄正常大鼠短且细,骨间隙增大,钙化不良.20日缺碘鼠肌骨远端骨骺病理切片显示,大鼠次级骨化中心形成迟缓且小,骨骺生长中几个软骨细胞区域层次混乱,储备细胞数目减少.增殖区宽度较正常大鼠者减少;甲状腺病理学变化显示,从生后1 d开始,碘缺乏大鼠已经出现了甲状腺肿大的典型变化,包括滤泡体积变小,形状不规则,胶质明显减少或缺如.滤泡上皮细胞增大呈柱状,胞浆淡染,有空泡变性,滤泡间小血管增多,充血明显.生后补碘可以部分纠正上述改变.结论缺碘导致大鼠发育迟缓,体重增长缓慢.骨骼发育不良,长骨骨骺软骨发育障碍,钙化过程也受到影响.生后给缺碘大鼠补碘可以改善骨骼发育.     

骨形态发生蛋白-7生物学功能的研究进展

最初发现骨形态发生蛋白(BMP)-7的作用是异位诱导成骨,并根据这一特点应用于治疗临床一些难治性骨缺损疾病.新近发现BMP-7还与泌尿系统、生殖系统关系密切,可用于治疗动物模型中缺血性肾病、炎性肾病、高转换率肾性骨营养不良和血管钙化等.因此,BMP-7具有广泛的功能与应用前景.