LHBs与C53蛋白在肝癌细胞系HepG2中的共定位及结合区域研究

目的研究肝癌细胞系HepG2中乙型肝炎表面抗原大蛋白（hepatitis B virus large surface protein，LHBs）与C53蛋白是否存在共定位，查明LHBs与C53蛋白的结合区域。方法分别构建pEGFP-C1·LHBs和pDsRedl-N1·C53质粒，共同转染肝癌细胞系HepG2，激光共聚焦观察它们在细胞内的共定位。构建质粒pCDNA-3．1（-）myc／his-LHBs和pCMV-5a-C53，并将C53基因截短构建质粒pCMV-5a-C53N、pCMV-5a-C1、pCMV-5a-C2和pCMV．5a-C3，将pCDNA-3．1（-）myc／his．LHBs和pc-MV-5a-C53及各截短质粒共转染HepG2细胞，免疫共沉淀方法验证LHBs结合的C53区域。结果成功构建pEGFP-C1-LHBs、pDsRedl-N1-C53、pCDNA-3．1（-）myc／his-LHBs、pCMV-5a-C53、pCMV-5a-C53N、pCMV-5a-C1、pCMV-5a-C2和pCMV-5a-C3质粒；用激光共聚焦的方法证实了LHBs与C53在HepG2细胞内存在共定位；免疫共沉淀方法证实了在HepG2细胞内LHBs与C53的结合区域为其c1区。结论LHBs与C53在肝癌细胞系HepG2内存在明确的相互作用，但仍需做进一步的功能研究。     

丙型肝炎病毒 NS4A蛋白在胰腺细胞 cDNA文库中的结合蛋白基因的筛选

目的:从人胰腺细胞cDNA文库中筛选出与丙型肝炎病毒(HCV)NS4A蛋白存在相关作用并且参与糖、脂类代谢过程的结合蛋白,为研究HCV影响糖、脂类代谢的分子生物学机制提供实验依据.方法:构建pGBKT7-NS4A作为诱饵质粒,转化酵母菌株AH109,用SD/-Trp筛选阳性菌落.配合两种重组酵母菌株AH109与Y187...     

肝硬化合并自发性细菌性腹膜炎患者腹水培养阳性的病原菌分析

目的探讨肝硬化合并自发性细菌性腹膜炎(SBP)的临床诊断及病原菌分布特点。方法以我院2001年1月至2003年4月诊断为肝硬化合并 SBP 腹水细菌培养结果阳性的住院患者为研究对象,详细记录患者的体温、腹部症状、体征、血常规、腹水中白细胞总数、多核细胞数(PMN)、腹水培养、耐药情况以及治疗和转归。结果发热81例(76.4%),腹痛60例(56.6%),腹部压痛或反跳痛55例(51.9%);血常规:白细胞(WBC)≥10×10~9/L 37例(34.9%),中性粒细胞≥0.7 91例(85.8%);腹水检查:白细胞总数>0.5×10~9/L 47例(44.3%),PMN≥250个/mm~3 40例(37.7%);细菌培养共分离出细菌109株25种,103例患者为单菌感染,占97.2%,革兰阴性菌89例(81.7%),分别是大肠埃希菌和肺炎克雷伯杆菌,革兰阳性菌15例(13.8%),真菌5例(4.5%);药敏试验无耐药者9例(8.3%),单类耐药者6例(5.5%),3类以上(包括3类)抗菌药物耐药细菌76例(69.7%);治愈好转52例(49.1%),自动出院8例(7.5%),死亡46例(43.3%),其中25例(53.4%)死于肝肾综合征。结论 1.对肝硬化患者判断有无合并 SBP 除应尽早进行腹水培养外,需根据临床症状、体征、血常规、腹水常规检查等综合分析。2.SBP 感染的病原菌绝大多数为肠道内正常菌群,革兰阴性菌为主,单一菌种多见。3.预后差,耐药率升高是影响预后的主要原因之一,死因主要为肝肾综合征。     

肝硬化合并自发性细菌性腹膜炎临床诊断标准及其病原菌分析

目的探讨肝硬化合并自发性细菌性腹膜炎（SBP）的临床诊断标准及病原菌分布特点。方法以肝硬化合并SBP腹水细菌培养阳性的患者共106例为观察对象，详细记录患者症状、体征、辅助检查以及治疗和转归。结果患者症状表现为发热、腹痛、腹泻、腹部压痛或反跳痛；血常规自细胞及中性粒细胞升高；腹水白细胞总数及多核细胞数（PMN）升高；细菌培养共分离出细菌109株25种，革兰阴性菌87株，革兰阳性菌17株，真菌5株。结论判断肝硬化患者有无合并SBP应尽早行腹水培养，且需根据临床症状、体征、多项辅助检查指标等进行综合分析；SBP感染的病原菌绝大多数为肠道内正常菌群，以革兰阴性菌为主，单一菌种多见；SBP患者预后差，耐药率升高可影响预后。     

hHGF转染HepG2细胞后基因表达谱差异筛选

目的:构建hHGF真核表达载体,并在HepG2细胞中表达,筛选其对HepG2细胞的差异表达基因.方法:构建pcDNA3.1(-)-hHGF载体,测序鉴定:转染HepG2细胞后蛋白免疫印迹检测:运用基因表达谱芯片技术,筛选pcDNA3.1(-)-hHGF和pcDNA3.1(-)载体分别转染HepG2细胞后,提取mRNA并逆转录为cDNA,经表达谱芯片分析差异表达基因.结果:构建的表达载体经酶切和测序确定;转染HepG2细胞后hHGF表达经蛋白免疫印迹证实;经20000个基因的表达谱芯片分析发现,其中有430个基因表达水平显著上调,88个基因表达水平显著下调.结论:筛选出HGF转染HepG2细胞后的差异表达基因,对其在肝细胞中多种作用机制研究提供了重要依据.     

HBV复制子pHY106-BHBV转染HepG2细胞基因表达差异

目的:研究乙型肝炎病毒复制子pHY106-BHBV转染肝癌细胞系基因表达谱的差异,分析参与胆固醇代谢的差异表达基因.方法:应用包含20 000条人类全长基因的寡聚核苷酸芯片ImaGene3.0检测乙型肝炎病毒复制子pHY106-BHBV转染肝癌细胞系基因表达谱差异,并选择其中参与胆固醇代谢的表达下调基因7-脱氢胆固醇还原酶和NADH-细胞色素b5还原酶,用RT-PCR方法进行验证分析.结果:基因芯片筛选出差异表达的基因,其中包括转录因子、细胞周期素、细胞因子相关蛋白、糖脂类物质代谢相关酶及细胞信号转导相关因子等,RT-PCR验证参与胆固醇代谢的几种表达差异的基因,其中7-脱氢胆固醇还原酶和NADH-细胞色素b5还原酶表达明显下调,与基因芯片分析结果一致.结论:乙型肝炎病毒复制子pHY106-BHBV转染肝癌细胞系存在基因表达差异,乙型肝炎病毒感染可能通过抑制参与胆固醇代谢的7-脱氢胆固醇还原酶和NADH-细胞色素b5还原酶从而进一步影响机体胆固醇代谢.     

人胰腺细胞cDNA文库中丙型肝炎病毒E1结合蛋白基因的筛选

目的 应用酵母双杂交技术筛选人胰腺细胞cDNA文库中与HCV包膜糖蛋白E1相互作用的结合蛋白的编码基因.方法 扩增人胰腺细胞cDNA文库并经纯化鉴定后,将文库质粒转化酵母菌株Y187.诱饵质粒pGBKT7-E1转化酵母菌株AH109,在色氨酸缺陷型培养基(SD/-Trp)上筛选阳性菌落.应用酵母双杂交系统3将阳性重组AH109菌株与重组酵母菌株Y187进行配合,在四缺培养基(SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade)和铺有X-α-gal的四缺培养基上进行筛选,提取蓝色酵母菌落质粒,电转化大肠埃希菌DH5α后再提取质粒测序.测序结果进行序列比对.结果筛选出16种与HCV E1蛋白相结合的蛋白基因.结论在筛选出的与HCV E1蛋白结合的人胰腺细胞蛋白基因中,部分可能与糖、脂类代谢密切相关.     

人胰腺细胞cDNA文库中丙型肝炎病毒NS4B结合蛋白基因的筛选

目的应用酵母双杂交技术筛选人胰腺细胞cDNA文库中与HCV包膜糖蛋白NS4B相互作用的结合蛋白的编码基因。方法扩增人胰腺细胞cDNA文库进行纯化鉴定,并将文库质粒转化酵母菌株Y187。诱饵质粒pGBKT7-NS4B转化酵母菌株AH109,在色氨酸缺陷型培养基（SD/-Trp）上筛选阳性菌落。应用酵母双杂交系统3将阳性重组AH109菌株与重组酵母菌株Y187进行配合,在四缺培养基（SD/-Trp/-Leu/-H is/-Ade）和铺有X-α-gal的四缺培养基上进行筛选,提取蓝色酵母菌落质粒,电转化大肠埃希菌DH5α后再提取质粒测序。测序结果进行序列比对。结果成功构建人胰腺cDNA文库以及pGBKT7-HCV NS4B重组质粒,筛选出7种与HCV NS4B蛋白相结合的蛋白基因。结论筛选出的与HCV NS4B蛋白结合的人胰腺细胞蛋白基因中,部分与2型糖尿病、肝脏脂肪变性密切相关。     

肝硬化合并自发性细菌性腹膜炎临床诊断标准及其病原菌分析

目的探讨肝硬化合并自发性细菌性腹膜炎(SBP)的临床诊断标准及病原菌分布特点。方法以肝硬化合并SBP腹水细菌培养阳性的患者共106例为观察对象,详细记录患者症状、体征、辅助检查以及治疗和转归。结果患者症状表现为发热、腹痛、腹泻、腹部压痛或反跳痛;血常规白细胞及中性粒细胞升高;腹水白细胞总数及多核细胞数(PMN)升高;细菌培养共分离出细菌109株25种,革兰阴性菌87株,革兰阳性菌17株,真菌5株。结论判断肝硬化患者有无合并SBP应尽早行腹水培养,且需根据临床症状、体征、多项辅助检查指标等进行综合分析;SBP感染的病原菌绝大多数为肠道内正常菌群,以革兰阴性菌为主,单一菌种多见;SBP患者预后差,耐药率升高可影响预后。     

2011年度288例儿童手足口病住院患者的病原学分析

目的了解2011年北京大学北京地坛医院教学医院儿童手足口病住院患者的病原体分布情况及变化趋势,为手足口病的预防、诊断及治疗等提供依据。方法本研究共收集288例手足口病患者的咽拭子标本,使用肠道病毒通用型、肠道病毒71型和柯萨奇16型核酸检测试剂盒应用实时荧光逆转录-聚合酶链反应法(real-time PCR)进行检测。结果 2011年度本院肠道病毒阳性标本占51.74%(149/288)。病毒分型结果显示,EV71阳性标本占总标本例数的23.26%(67/288);CoxA16阳性标本占7.29%(21/288);非EV71非CoxA16型阳性标本占21.18%(61/288)。2009至2011年北京地区的手足口病病原学分析结果显示,3年间EV71阳性率变化并不明显;CoxA16阳性率显著下降;非EV71非CoxA16型阳性率显著升高。结论 2011年度本院手足口病患儿在主要流行期以EV71和非EV71非CoxA16型肠道病毒感染为主;北京地区2011年手足口病病原学和前两年相比非EV71非CoxA16型感染比例继续升高。