HBV pre-X转染HepG2细胞后差异表达基因的筛选

目的:检测HBV Pre-X在真核表达栽体PcDNA3.1-myc-his-HBV pre-X转染的HepG2细胞中的表达,并筛选其中的代谢相关差异表达基因.方法:将构建的真核表达载体pcDNA3.1-mychis-HBV pre-X转染HepG2细胞后蛋白免疫印迹检测:将pcDNA3.1-myc-his-HBV pre-X和pcDNA3.1-myc-his载体分别转染HepG2细胞后,提取mRNA后逆转录为cDNA,运用基因表达谱芯片技术分析差异表达基因.结果:构建的真核表达载体经ApsI、BstXI双酶切鉴定,转染HepG2细胞后HBV pre-X表达经蛋白免疫印迹证实:经基因表达谱芯片分析发现,其中基因表达水平显著上调和下调的分别是200个和62个.结论:筛选HBV pre-X转染HepG2细胞后的代谢相关差异表达基因,从而为乙型肝炎病毒合并糖尿病、脂肪肝等代谢性疾病的分子生物学机制的研究提供了重要依据.     

HCV NS5A结合蛋白顺乌头酸酶1的验证研究

目的筛选人肝脏cDNA文库中与HCV NS5A的结合蛋白基因,验证其中顺乌头酸酶1与HCV NS5A的相互作用。方法应用酵母双杂交系统3筛选人肝脏cDNA文库中的HCV NS5A结合蛋白基因,应用哺乳动物双杂交及免疫共沉淀技术验证其中顺乌头酸酶1蛋白与HCV NS5A之间的相互作用。结果成功筛选出人肝脏cD-NA文库中与HCV NS5A存在相互作用的蛋白基因,哺乳动物双杂交及免疫共沉淀实验结果证实HCV NS5A与顺乌头酸酶1蛋白在HepG2细胞内存在相互作用。结论本实验成功筛选人肝脏cDNA文库中的HCV NS5A结合蛋白基因,并且在体外水平即细胞内证实HCV NS5A与其中的顺乌头酸酶1蛋白之间的相互作用,为进一步细胞内及体内的糖、脂类代谢等功能研究奠定基础。     

人胰腺细胞cDNA文库中丙型肝炎病毒核心蛋白结合蛋白基因的筛选

目的 为进一步研究HCV影响糖、脂代谢机制奠定研究基础.方法 扩增人胰腺cDNA文库并经纯化鉴定后,将文库质粒转化酵母菌株Y 187.诱饵质粒pGBKT7-core转化酵母菌株AH109,在色氨酸缺陷型培养基(SD/-Trp)上筛选阳性菌落.应用酵母双杂交系统3将阳性重组AH109菌株与重组酵母菌株Y187进行配合,在四缺培养基(SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade)和铺有X-α-gal的四缺培养基上进行筛选,提取蓝色酵母菌落质粒,电转化大肠埃希菌DH5α后再提取质粒测序,测序结果进行序列比对.结果 筛选出11种与HCV核心蛋白相结合的蛋白基因,包括胰凝乳蛋白酶原B1前体、羧肽酶A1,胰蛋白酶原2、胰凝乳蛋白C、胰蛋白酶1,羧肽酶B1、驱动蛋白家族3B、胰蛋白酶2,线粒体蛋白基因、弹性蛋白酶3A,辅脂肪酶.结论 在筛选出的HCV核心蛋白结合的人胰腺细胞蛋白基因中,部分与糖,脂代谢密切相关.     

丙型肝炎病毒不同基因型核心蛋白对肝母细胞瘤细胞凋亡影响的比较

目的比较HCV不同基因型核心蛋白(core)在肝母细胞瘤细胞凋亡中的作用。方法构建6a基因型HCV core的表达载体pcDNA3.1/myc-His(-)-core(6a)[pCore(6a)];分别将1b、3a和6a基因型HCV core质粒以及空质粒pcDNA3.1/myc-His(-)(pNC)瞬时转染HepG2细胞,48小时后利用流式细胞术检测细胞凋亡发生的情况;利用Real-time PCR检测胱冬肽酶-3的mRNA水平变化;利用化学发光法检测胱冬肽酶-3的活性变化,比较HCV不同基因型core对细胞凋亡作用的差异。结果成功构建了6a基因型HCV core的表达载体pcDNA3.1/myc-His(-)-core(6a)[pCore(6a)];与pNC组相比,表达1b、3a和6a基因型HCV core的HepG2细胞中,Annexin V+细胞数均显著减少,其中6a基因型core较1b和3a基因型core作用显著(P=0.000、0.001);同时实验组中凋亡效应分子胱冬肽酶-3的mRNA水平及其活性较对照组均降低;其中与1b和3a基因型core相比较,6a基因型core显著降低胱冬肽酶-3的mRNA水平,而在抑制胱冬肽酶-3活性方面无显著差别。结论 HCV不同基因型core对细胞凋亡的作用不同;基因6a型core对细胞凋亡的抑制作用更为显著;HCV基因6型核心蛋白可能更易导致肝癌的发生,有待进一步研究。     

2009—2010年北京地区麻疹流行的临床与病因学特征

目的：分析2009—2010年北京地坛医院收治的麻疹患者的临床及病因学特征。方法：回顾分析200例麻疹患儿的临床资料,选择同一地区200例年龄、性别相匹配的健康儿童作为对照。结果：感染麻疹的患儿的麻疹疫苗接种率和全程计划免疫率明显低于健康儿童;2010年麻疹患者病情严重复杂,2010年麻疹患者流动人口比例高于2009年;2010年体温超过38.5℃的患者比例高于2009年;2009、2010年患者都出现皮疹,但皮疹首发部位差异有统计学意义。2010年并发症（支气管炎、喉炎、心肌炎、心血管功能不全、口腔炎及呼吸衰竭）比例与2009年相比显著升高,差异有统计学意义。2010年19例患儿因并发呼吸衰竭入住重症监护室,7例病死;2009年无病死病例。结论：2010年北京地区麻疹高发病率可能与麻疹疫苗免疫的低覆盖率及人口流动有关,麻疹病毒基因型变异也可能是原因之一。     

慢性丙型肝炎并脂肪肝血清A-FABP与病毒及代谢的相关分析

目的 探讨慢性丙型肝炎(chronic hepatitis C,CHC)并脂肪肝(fatty liver,FL)血清脂肪细胞型脂肪酸结合蛋白(A-FABP)水平与病毒和代谢因素的相关性.方法 选择118例初次就诊且未行抗病毒治疗的CHC,根据是否伴FL分为FL组55例和非FL组63例.检测两组A-FABP水平,并比较其水平与丙型肝炎病毒、血清丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、体重指数(BMI)、空腹血糖(FPG)、胰岛素水平(FINS)、甘油三酯(TG)、胆固醇(CHO)及胰岛素抵抗指数(HO-MA-IR)等的相关性.结果 FL组TG较非FL组明显升高,FINS、HOMA-IR及A-FABP血清水平明显低于非FL组(P＜0.05).相关性及回归分析表明,A-FABP同BMI、FPG、FINS、HOMA-IR明显呈正相关,并且同TG水平明显负相关,FINS是A-FABP水平的独立相关因素(r2=0.830,P＜0.01).结论 CHC并发FL与患者血清A-FABP水平下降密切相关,与病毒因素不相关,且FINS是此类患者A-FABP水平变化的独立相关因素.     

HBV表面抗原大蛋白与人胰腺CDK5RAP3蛋白的亚细胞定位研究

目的 运用激光共聚焦显微技术对CDK5RAP3与LHBs进行亚细胞定位研究,为进一步研究HBV影响糖、脂类代谢的分子生物学机制提供一定的思路和方向.方法 应用酵母双杂交系统筛选人胰腺cDNA文库中的LHBs结合蛋白基因,构建真核表达质粒pDsRed1-N1-CDK5RAP3,应用激光共聚焦显微技术对CDK5RAP3与LHBs进行亚细胞定位研究.结果 成功构建真核表达质粒pDsRed1-N1-CDK5RAP3,转染了pDsRed1-N1-CDK5RAP3质粒的细胞,红色荧光信号较集中分布于细胞浆中,与经DAPI染色的细胞核无重叠.结论 证实LHBs基因和CDK5RAP3基因在体内可以表达蛋白,并提示LHBs蛋白和CDK5RAP3蛋白均主要定位在细胞浆内.     

Sirt1在胃癌及癌旁组织中的表达差异研究

目的应用寡聚核苷酸基因表达谱芯片研究胃癌组织与癌旁组织的基因表达谱差异。方法应用包含44,000条人类全长基因的寡聚核苷酸芯片检测胃癌组织与癌旁组织,并比较存在两者之间存在明显上、下调的表达差异基因,随后用RT—PCR方法进行验证分析。结果基因芯片筛选出存在差异表达的基因,Siftl基因的表达水平在胃癌组织均存在明显下调,下降至对应癌旁组织的（0．318±0．032）～（0．169±0．013）倍不等（t=-3．374,P〈0．05）。经RT—PCR对胃癌组织与癌旁组织中Sift1基因的表达水平进行比较,发现胃癌组织中的实时荧光定量PCR的比值为0．258（X2=5．20,P〈0．05）,与基因芯片的结果一致。结论Sirt1在胃癌组织与癌旁组织中的表达存在明显差异,Sirt1基因的表达可能与胃癌的发生发展密切相关。     

HCV核心蛋白通过LXRα核受体介导HepG2细胞甘油三酯合成增加

目的：观察丙型肝炎病毒（HCV）的核心蛋白（core）对肝细胞甘油三酯（TG）合成的影响。方法将HCV 1b基因型core表达载体pcDNA3.1-myc/his（-）-core1b和HCV 3a基因型core表达载体pcDNA3.1-myc/his（-）-core3a分别转染至HepG2细胞,利用定量测定法检测细胞内TG含量,用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应法（real time qPCR）、蛋白免疫印迹（Western blot）方法观察脂质合成相关基因肝X受体α（LXRα）、甾醇调节元件结合蛋白1c（SREBP1c）和脂肪酸合酶（FASN）的mRNA和蛋白的表达变化,并进行比较分析。结果 HepG2细胞转染两个基因型HCV core表达载体之后均能显著增加细胞内的TG含量（P＜0.05）,尤以基因型core3a组为差异更显著（P＜0.001）。Real-time PCR结果显示,两个基因型core均上调LXRα的mRNA水平（P＜0.05）,基因型core3a组差异更为显著（P＜0.01）;FASN的mRNA水平只在仅在基因型core3a组上调（P＜0.05）,而基因型core1b组差异无统计学意义。Western blot结果显示,HCV core表达可以明显上调表达可以显著上调SREBP1c的蛋白水平,尤其基因型core3a组更为显著。对FASN蛋白水平,基因型core3a上调其表达,但基因型core1b组无明显变化。结论 HCV可能通过LXRα介导肝细胞内的脂质合成诱导肝脂肪变,有待进一步研究。     

2012年度211例手足口病住院患儿病原学检测及分析

目的：掌握2012年度北京大学北京地坛医院教学医院手足口病住院患儿的病原体分布情况与变化趋势,为手足口病的防治提供科学依据。方法本研究收集北京大学北京地坛医院教学医院儿科2012年度211例手足口病住院患儿的咽拭子标本,提取病毒RNA,采用实时荧光聚合酶链反应（RT-PCR）法,进行肠道病毒（EV）通用型、肠道病毒71（EV71）型和柯萨奇A16（CoxA16）型肠道病毒核酸检测。EV（＋）标本判为EV阳性,EV（＋）EV71（＋）标本判为EV71阳性,EV （＋）CoxA16（＋）标本判为CoxA16阳性,EV（＋）且EV71（-）CoxA16（-）标本判为非EV71非CoxA16型肠道病毒阳性。结果2012年度211例本院手足口病住院患儿中EV阳性标本共118例,占55.92%。病毒分型结果显示,非EV71非CoxA16型肠道病毒阳性标本共46例,占22.81%;EV71阳性标本共45例,占21.32%;CoxA16阳性标本共27例,占12.80%。病原学分布分析结果显示,5～7月份为发病高峰期;不同年龄、性别组患儿之间病原体构成无显著差异;患儿入院前3d肠道病毒检出率较3 d后高;不同型别肠道病毒感染患儿之间平均住院天数差异无统计学意义。结论2012年度本院手足口病住院患儿不同型别EV感染率由高到低依次为：非EV71非CoxA16型肠道病毒、EV71、CoxA16,非EV71非CoxA16型肠道病毒感染率较往年具有升高趋势,尚待进一步研究。