5氮杂脱氧胞苷对鼻咽癌细胞RASSF1A基因甲基化和mRNA表达的影响

目的:研究5氮杂脱氧胞苷对鼻咽癌CNE2细胞中RASSF1A基因甲基化和mRNA表达的影响。方法:用不同浓度(0、5、10、20μmol/L)5氮杂脱氧胞苷处理CNE2细胞,采用甲基化特异性PCR(MSP)法对处理后细胞中RASSF1A基因甲基化状态进行检测;并用SYBR Green qReal Time-PCR法检测RASSF1A mRNA的表达。结果:阴性对照组CNE2细胞中,RASSF1A基因呈完全甲基化状态,当用5μmol/L 5氮杂脱氧胞苷处理后,CNE2细胞出现非甲基化产物,20μmol/L 5氮杂脱氧胞苷处理后,CNE2细胞甲基化状态完全被逆转,均为非甲基化产物。阴性对照组CNE2细胞RASSF1A基因呈低表达,经5～20μmol/L 5氮杂脱氧胞苷处理后,RASSF1A mRNA的相对表达量逐渐增加,10和20μmol/L 5氮杂脱氧胞苷处理组,RASSF1A mRNA表达水平均明显高于阴性对照组(P0.01);且20μmol/L处理组明显高于5μmol/L处理组(P0.01)。结论:CNE2细胞RASSF1A基因甲基化可以被5氮杂脱氧胞苷逆转,且5氮杂脱氧胞苷可促进RASSF1A mRNA的表达。     

乳头状甲状腺癌促甲状腺激素受体第十外显子基因突变研究

目的研究乳头状甲状腺癌发病是否与促甲状腺激素受体(TSHR)第十外显子基因突变有关：方法采用NEST—PCR—SSCP(巢氏多聚酶联反应-单链构象多态性分析)方法及DNA测序方法，对65例乳头状甲状腺癌和44例对照组织TSHR第十外显子基因进行检测。结果经NEST—PCR—SSCP检测，65例乳头状甲状腺癌TSHR第十外显子未发现明显带型异常，第三片段取2例对照组织和3例甲状腺癌组织进行DNA测序，5例组织TSHR2000位点碱基均由C→T，使得所编码的601位氨基酸由组氨酸(CAT)→酪氨酸(TAT)(His→Tyr)，余无明显基因突变。结论乳头状甲状腺癌TSHR第十外显子未发现基因突变，提示乳头状甲状腺癌发病与TSHR第十外显子基因突变无关；由于所测5例标本601位氨基酸均为酪氨酸，考虑中国人TSHR基因与国外人群存在差异。     

人脐血干细胞分化为肝细胞的研究

目的探讨人脐血干细胞是否可以在体外模拟的肝损伤微环境中转化为肝细胞。方法将脐血单个核细胞(MNC)与受损伤小鼠肝脏共培养，采用RT—PCR方法对培养72h细胞的白蛋白(ALB)和GATA4 mRNA水平进行检测；同时用免疫细胞化学染色方法于不同培养时间检测培养细胞中ALB、甲胎蛋白(AFP)的表达。结果RT—PCR显示共培养72h时ALB、GATA4 mRNA表达为阳性。对照组人肝组织两者表达呈阳性，而同期培养的脐血MNC、正常小鼠肝脏组织及小鼠受损肝脏组织两者mRNA表达均呈阴性。免疫细胞化学染色进一步发现：共培养组于培养72h时ALB表达为阳性、AFP表达为阴性；培养48h时AFP染色呈阳性反应。同期培养的MNC细胞ALB、AFP免疫染色均为阴性。结论在脐血MNC与受损伤肝脏共培养的条件下，脐血干细胞有向肝细胞分化的趋向。     

人TGF-β2特异性siRNA质粒的构建

目的:构建人TGF-β2特异性siRNA质粒。方法:从NCBI中查找人TGF-β2的mRNA序列,并利用生物信息学对序列进行分析;根据siRNA的设计原则,选择最佳的siRNA序列;利用限制性内切酶BamHⅠ和BbsⅠ将相应的双链DNA插入到GPU6/GFP/Neo载体中;重组质粒经限制性内切酶BamHⅠ和PstⅠ单酶切进行鉴定,鉴定正确的质粒进一步通过基因测序的方法进行验证。结果:根据生物信息学选择TGF-β2mRNA的1016～1034区域作为干扰位点;重组质粒酶切结果表明双链DNA序列成功插入到了GPU6/GFP/Neo载体中;测序分析结果进一步证明插入序列与设计完全一致。结论:成功构建了人TGF-β2特异性siRNA干扰质粒,为研究TGF-β2基因功能和利用基因治疗的方法提高青光眼滤过手术成功率奠定了实验基础。