表达人干扰素α-2b基因重组乳杆菌的鉴定及其抗病毒活性的动态研究

目的:进一步鉴定表达人干扰素α-2b的重组乳杆茵DM8909/pSC111AE-IFN-α-2b,考察重组茵的培养条件及其表达产物动态的抗病毒活性.方法:在LRS培养基培养重组菌株DM8909/pSC111AE-IFN-α-2b并诱导表达,用Western印迹鉴定培养上清中的表达产物,对重组菌株在LRS培养基中的不同时间的D600、pH值、活菌数、表达产物抗病毒活性进行动态观察.结果:Western印迹鉴定证实了重组茵上清中的IFN-α-2b.重组菌培养18 h后pH值由6.5开始下降,56 h后降至3.5;细菌于培养21 h进入对数期,32 h进入稳定期;培养24～32 h上清中干扰素抗病毒活性为4.08×105U/ml.结论:重组乳杆菌DM8909/pSC111AE-IFN-α-2b可表达IFN-α-2b于培养上清,培养24～32 h上清中干扰素含量最高,可用于预防及治疗病毒感染的进一步研究.     

H5N1流感病毒M1蛋白免疫制备的单克隆抗体的研究

目的 制备抗人流感病毒H5N1株M1蛋白的单克隆抗体,为流感的快速诊断和研究提供新的工具.方法 应用在大肠埃希菌中表达的人H5N1亚型禽流感病毒(A/Anhui/1/2005)株M1蛋白,以纯化的表达产物免疫BALB/c小鼠,取脾细胞与sp2/0细胞系作细胞融合后,间接ELISA法筛选阳性的杂交瘤细胞,并应用间接免疫荧光法对抗体的特异性进行鉴定.结果 获得3株能稳定分泌抗禽流感病毒M1抗原的McAb杂交瘤细胞株,交叉反应试验及间接免疫荧光检测表明,三株McAb具有型特异性.结论 用H5N1禽流感病毒M1蛋白免疫制备的单克隆抗体,具有一定的交叉反应性,可用于多种亚型甲型流感病毒的检测.     

阳离子脂质体联合转铁蛋白对人肿瘤细胞的靶向基因转染

目的研究阳离子脂质体联合转铁蛋白(transferrin ,Tf)介导报告基因虫荧光素酶基因对人肿瘤细胞的靶向转染。方法比较阳离子脂质体Lipofectin、Lipofectin联合含双铁的人转铁蛋白[HTf(Fe) 2 ]介导质粒pDR2 luc转染人肝癌细胞株HepG2 、SMMC772 1、人肾癌细胞株GRC及非洲绿猴肾细胞COS7的转染效率,转染效率通过以液体闪烁计数仪单光子计数法测定荧光素酶活性估计。结果除COS7外,其余3株细胞以Lipofectin联合HTf(Fe) 2 介导pDR2 luc的转染效率均比单用Lipofectin的转染效率高(P <0 0 1) ,其中HepG2 与SMMC772 1中的转染效率增高8倍多,GRC中的转染效率增高4倍多。结论Lipofectin联合HTf(Fe) 2 介导质粒pDR2 luc转染细胞时对人肿瘤细胸株有一定的靶向作用。     

人B7逆转录病毒基因转移体系的建立及在肾癌细胞中的表达

将人Ｂ７基因亚克隆到逆转录病毒载体ｐＬＸＳＮ中，构建了人Ｂ７逆转录病毒载体ｐＬＸＳＮＢ７，经Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ介导转染包装细胞，并通过Ｇ４１８筛选获得较高病毒滴度的细胞株ＰＡ３１７／ｐＬＸＳＮＢ７（３×１０５～１×１０６ｃｆｕ／ｍｌ）。用此逆转录病毒基因转移体系将Ｂ７基因转移到肾癌ＧＲＣ１细胞中，经ＲＴＰＣＲ、间接免疫荧光及ＬＳＡＢ细胞免疫组化等检测方法检测到转基因细胞中Ｂ７ｍＲＮＡ及Ｂ７分子的表达。介导人Ｂ７基因的逆转录病毒基因转移体系的建立，为人肾癌转基因瘤苗的应用研究提供了实验基础。     

DNA疫苗及其在流感病毒疫苗研究中的应用

DNA疫苗能够诱导广谱免疫反应，已被广泛应用于预防性疫苗和针对各种感染性疾病、肿瘤、自身免疫性疾病和过敏性疾病的免疫治疗的临床试验。自DNA疫苗技术出现，A型流感病毒就与其紧密地联系在一起，已被广泛应用于小鼠和其他动物模型以研究DNA疫苗的免疫作用和机理。     

应用PCR技术构建人IL4高效表达克隆

在组建成功人白细胞介素4(hIL 4)表达质粒PBV 220/hIL 4基础上,应用多聚酶链式反应(PCR)技术、构建成hIL 4高效表达克隆,命名为PBV220/hIL4a。核酸序列分析证明该质粒不但去除了hIL 4终止密码TGA后200bp的3′末端侧翼区核苷酸,还以定位突变技术改原终止密码TGA为原核系统强终止密     

血管内皮生长因子受体KDR胞外区基因对裸鼠人膀胱癌生长的影响

目的研究血管内皮生长因子(VEGF)受体KDR胞外区基因对肿瘤新生血管的抑制作用.方法采用脂质体转染技术,将KDR胞外区基因的真核表达质粒pcDNA3.1/KDRn7转入人膀胱癌EJ细胞,用G418筛选得到稳定表达目的蛋白的细胞克隆,经固相结合实验筛选得到表达与VEGF特异结合的目的蛋白的细胞克隆,阳性细胞克隆进行了RT-PCR鉴定.结果鸡胚测活表明,EJ细胞表达rKDRn7的能抑制鸡胚绒毛尿囊膜的血管形成;表达rKDRn7的EJ细胞株对裸鼠人膀胱癌生长及血管生成明显抑制,实验组的微血管密度(MVD)为12±4,阴性对照组62±11.结论阻断VEGF/KDR信号传导途径能够抑制肿瘤新生血管的形成,延缓肿瘤的生长速度.     

四环素抗性表型筛选外源基因高效表达克隆

目的 :应用四环素抗性表型从外源基因的cDNA文库中筛选高效表达克隆。方法 :将四环素抗性基因(TetR)克隆到载体pBV2 2 0 中构建筛选载体pBV2 2 3 ;根据氨基酸密码子的简并性 ,在保持原有氨基酸序列不变的情况下 ,人工合成外源基因的cDNA 5′端简并引物库 ,以hGM CSF基因为例进行筛选。把hGM CSFcDNA简并文库克隆到pBV2 2 3 中的TetR 上游位置 ,构建pBV2 2 3 /hGM CSF克隆文库 ,导入大肠杆菌DH5α中 ,构建转基因的细菌文库 ,在不同质量浓度 (2 0mg/L ,40mg/L ,5 0mg/L ,6 0mg/L)的四环素培养基中培养。结果 :从高浓度四环素培养基中获得高效表达的pBV2 2 3 /hGM CSF克隆 ,测序结果显示该克隆的hGM CSFcDNA 5′端序列与天然序列比较有 7个碱基发生突变 ,且符合实验设计的要求。通过基因重组 ,构建成最终的高效表达克隆pBV2 2 0 /hGM CSF ,其表达hGM CSF的量占细菌总量的 18% ,较原表达水平提高 80 %。结论 :可通过四环素抗性筛选系统筛选外源基因的高效表达克隆。     

G145R突变后HBsAg"a"决定簇合成肽的免疫学特性分析

目的研究G145R突变后乙肝表面抗原(HBsAg)"a"决定簇合成肽的免疫学特性改变情况. 方法首先合成2条短肽P1-wt和P2-145R,分别代表野毒株和G145R突变后HBsAg"a"决定簇合成肽.然后用β-巯基乙醇(2-ME)变性试验以及用乙肝疫苗标准品制备的小鼠多抗血清研究2条合成肽的空间构象以及抗原性异同.最后用等量合成肽免疫小鼠,用酶免疫法、竞争抑制试验和Western blot试验等研究G145R突变后"a"决定簇合成肽的免疫原性改变.结果合成肽P1-wt和P2-145R用2-ME温和变性后,PAGE结果表现为相对分子质量(Mr)为4×103左右的单一条带,而变性前2条合成肽均表现为Mr是从4×103到30×103的弥漫条带,主带位置在5×103和10×103,分别相当于二聚体和四聚体位置;用HBsAg的多克隆抗体(anti-HBs)检测合成肽的抗原性,结果在固定抗原量的前提下,在抗体1∶32 000稀释时仍可检测到P1-wt的阳性结果,而当同一抗体稀释到1∶8000时,P2-145R检测结果即为阴性.合成肽P2-145R免疫小鼠产生的抗体与P1-wt合成肽的反应滴度比与P2-145R合成肽本身的反应低4～8倍. 结论针对HBsAg"a"决定簇合成肽可自发形成一定的空间构象,G145R突变株的HBsAg"a"决定簇的抗原性和免疫原性与野毒株相比发生了明显改变,为正确评价G145R变异株的流行危害以及现行疫苗的保护效果提供了实验依据.     

应用酵母双杂交系统筛选与乙型流感病毒BM2相互作用的蛋白质

目的　筛选与乙型流感病毒BM2蛋白相互作用的蛋白质。方法　应用酵母双杂交系统,以BM2 (2 6 10 9)插入载体pGBKT7作为诱铒,在四缺培养基上筛选人KidneyMATCHMAKERcDNA文库,寻找与BM2蛋白相互作用的宿主蛋白。结果　筛选得到6个阳性AD 文库质粒,并用酵母双杂交实验验证了阳性AD 文库质粒与BM2的相互作用。将阳性AD 文库质粒测序并对测序结果做BLAST分析,发现它们分别是N 乙酰神经氨酸酶丙酮酸裂解酶,Angiopoietin 3、锌指蛋白2 5 1、核糖体蛋白S2 0、蛋白精氨酸N 甲基转移酶1(PRMT)、转录因子样1(TCFL1)。结论　BM2能与这些转录翻译功能相关的蛋白质相互作用,表明BM2蛋白在病毒生活周期中发挥重要作用。