大鼠结膜囊成纤维细胞TGFβ2特异性siRNA的筛选及其载体构建的研究

Objective As the expression of transfornfing growth factor β （TGF2 β） of tenon＇ s fibroblasts is important for filtering bleb scarring formation after glaucoma surgery, it is benefit for preventing filtering bleb scarring through inhibiting its expression. This paper was to screen the effects of different TGF2β siRNAs on the expression of TGF1β mRNA and to construct the specific TGF2β siRNAs plasmid vector of rat Tenon＇ s fibroblasts. Methods Four TGF1β siRNAs （ L1 , L2 , L3 , L4 ） were transcribed in vitro and then transferred to cultured Tenon＇ s capsule fibroblasts in 30 SD rats. RT-PCR was performed to evaluate the levels of TGF1β mRNA in both transferred cells, and untransferred cells were as the controls. The specific TGF2 β siRNAs plasmid vector was constructed according to the screened TGF1β siRNAs. Results The expression of TGF1β mRNA of fibroblasts transferred with only L4 （0. 163 ± 0. 009 ） was reduced significantly in comparison with the control group（0. 433 ± 0. 011 ）, hut the interference function of others siRNAs seemed to be inactive. The plasmid vector of siRNA specific for TGFβ2 was proved to be constructed successfully by detecting its sequence. Conclusion Different siRNAs is designed to target the relevant TGFβ2 mRNA of rats Tenon＇ s fibroblast. The vector of siRNA specific for TGFβ2 is of potent interference ability for target tissue.     

加味逍遥丸联合阿米替林治疗抑郁症疗效和依从性比较

目的 比较观察加味逍遥丸联合阿米替林与盐酸氟西汀治疗抑郁症的疗效、不良反应及依从性。方法 将符合CCMD-3抑郁发作诊断标准的64例患者随机分为两组,分别用加味逍遥丸联合阿米替林（中西药组,32例）和百优解（西药组,32例）治疗,于用药前及用药后2、4、12周时用汉密尔顿（HAMD）评定疗效,记录不良反应。从12周起定时随访至24周,比较两组疗效及依从性。结果 两组患者于治疗第2周时HAMD评分下降,西药组优于中西药组（P〈0．05）,第4周起两组临床疗效和评分差异均无显著性。12周至24周随访发现,中西药组复发3例,西药组因过早停药而复发14例。结论 加味逍遥丸联合阿米替林治疗抑郁症疗效与盐酸氟西汀相当,不良反应少,价格低廉。     

细粒棘球绦虫硫氧还蛋白过氧化物酶基因的克隆、表达及鉴定

目的克隆细粒棘球绦虫(Echinococcus granulosus,Eg)硫氧还蛋白过氧化物酶(thioredoxin peroxidase TPx)基因,构建原核表达载体,通过诱导表达,纯化融合蛋白抗原,免疫小鼠制备抗血清。方法从包囊中分离原头蚴,抽提总RNA,采用RT-PCR的方法扩增EgTPx基因,克隆到原核表达载体pET-41b中,转化大肠杆菌BL21,经过IPTG诱导目的基因表达,SDS-PAGE对表达蛋白进行分析,通过谷胱甘肽Sepharose4B层析柱分离纯化获得重组蛋白并免疫小鼠,制备抗血清。Western blot鉴定抗血清的特异性,ELISA测定抗体的效价。结果用PCR方法扩增获得的EgTPx基因长度为582bp,经酶切鉴定和序列测定,插入到原核表达载体的基因片段为EgTPx基因,SDS-PAGE结果显示表达融合蛋白相对分子质量约为54kDa,鼠抗EgTPx抗体能与融合蛋白和天然原头蚴抗原发生特异性反应;间接ELISA法测定该抗体效价为1∶256000。结论成功地制备了鼠抗EgTPx抗体,并能够特异识别原核表达的融合蛋白EgTPx和天然原头蚴抗原,为研制有效的包虫病疫苗及相关诊断试剂盒奠定了基础。     

细粒棘球绦虫分泌抗原B调控Th17/Treg抑制过敏性哮喘的研究北大核心CSCD

目的探讨细粒棘球蚴分泌抗原B(EgAgB)对过敏性哮喘的抑制作用及其机制。方法将32只小鼠随机分为4组(每组8只),其中A组为高剂量干预组(HAgB:20μg EgAgB+OVA),B组为低剂量干预组(LAgB:2μg EgAgB+OVA),C组为过敏性哮喘组(OVA),D组为PBS对照组。采用ELISA法检测小鼠抗体水平;HE、PAS组织染色检测小鼠肺组织病理变化及黏蛋白分泌水平;利用流式细胞术分析肺脏和脾脏组织中淋巴细胞的分群及活化比例。结果 EgAgB免疫小鼠血IgG、IgM和IgG2b抗体水平显著高于PBS对照组(D组)(P<0.01),IgG1、IgG2a和IgE水平与PBS对照组(D组)相比差异无统计学意义(均P>0.05);HE、PAS染色显示,EgAgB接种组与C组相比能够显著抑制小鼠气道炎症及气道粘液的分泌(均P<0.01);流式细胞术检测显示,免疫高剂量EgAgB组小鼠肺组织及脾脏组织嗜酸性粒细胞和Th17的数量显著减少(均P<0.01),Treg数量显著增多(P<0.01)。结论 EgAgB能够通过调节宿主免疫平衡抑制过敏性哮喘,可作为防治自身免疫性疾病和过敏性疾病的候选小分子蛋白。     

细粒棘球绦虫EgM123蛋白融合霍乱毒素B亚单位疫苗的构建表达及免疫原性研究

目的 构建和表达细粒棘球绦虫成虫特异表达EgM123基因与霍乱毒素B的融合蛋白(CTB-EgM123);并确定CTB-EgM123蛋白的抗原性。方法 将合成EgM123基因序列连接到pET28a/CTB原核表达载体中,并转化至大肠杆菌BL21中。利用IPTG诱导目的基因的表达;用SDS-PAGE及Western-Blotting对表达蛋白进行分析和鉴定;用纯化蛋白免疫小鼠及犬,用ELISA方法对小鼠及犬的血清抗体效价和肠黏液的抗体亚类进行分析。结果 PCR和测序确定CTB-EgM123基因片段长度为804 bp,pET28a/CTB-EgM123原核表达阅读框序列正确。在37 ℃条件下,经IPTG 0.4 mmol/L诱导5 h,获得CTB-EgM123高表达的包涵体蛋白,分子质量为37 kDa。免疫小鼠结果表明复性CTB-EgM123蛋白具较好免疫原性,抗体效价> 320 000;以IgG2a为主。检测免疫犬血清效价,结果发现用融合蛋白免疫后的犬血清抗体效价> 64 000,效价高于EgM123免疫组(t=0.0064,P< 0.05);且在4周时,抗体呈上升趋势,并能较长时间维持抗体水平。结论 原核表达载体pET28a/CTB-EgM123在大肠杆菌中成功表达,纯化蛋白接种小鼠和犬表明具有高的抗原性。表明CTB可以增强蛋白的免疫原性,并刺激小鼠和犬体内产生高水平的体液和黏膜免疫。本研究为研发犬用包虫病疫苗奠定了基础。     

传统方法和PCR法在结核分枝杆菌复合群菌种鉴定中的对比研究

目的 对结核分枝杆菌复合群菌种鉴定的传统方法与PCR法进行对比研究,为临床应用提供科学依据。 方法 分别采用传统结核分枝杆菌菌种鉴定方法（对硝基苯甲酸和噻吩-2-羧酸肼）和PCR法,对2010年4月至2011年5月新疆喀什胸科医院住院、临床确诊肺结核患者的313份（例）晨痰标本临床分离株进行菌种鉴定。立意抽样法抽出100份结核分枝杆菌、牛分枝杆菌及非洲分枝杆菌Ⅰ型菌株,用Spoligotyping法检测前两种方法结果的可靠性。 结果 传统方法检测出结核分枝杆菌253株,牛分枝杆菌60株;而PCR法检测出结核分枝杆菌306株,牛分枝杆菌1株,非洲分枝杆菌Ⅰ型6株,两者间差异无统计学意义(χ²=5.05, P=0.08),两者检测的一致率为79.87%（250/313）。传统方法和PCR法鉴定结果差异虽无统计学意义,但传统方法检测出牛分枝杆菌60株,而PCR法仅检测出牛分枝杆菌1株,差异有统计学意义(χ²=4.16, P=0.04),故用立意抽检100份菌株,用Spoligotyping检测出牛分枝杆菌2株,结核分枝杆菌90株、非洲分枝杆菌Ⅰ型6株,2株未能检出菌型;其和传统方法与PCR法的一致率分别为38.78%［（2+36）/98］、98.98%［（1+90+6）/98］。 结论 经过Spoligotyping法检测可知,在结核分枝杆菌复合群菌种鉴定中传统方法较PCR法耗时、繁琐,且不能较准确地鉴定出菌种,而PCR法可准确、快速的将其鉴定到亚种。     

绵羊脑多头蚴病45m基因在多头绦虫和细粒棘球绦虫不同发育阶段同源性的比较

目的研究绵羊多头蚴病45M重组蛋白的同源性。方法将多头蚴的45m基因片段亚克隆到pET41b表达质粒,构建45m-pET41b原核表达系统,诱导表达45M重组蛋白,制备小鼠高免血清,进行免疫印迹试验（Western blot）;运用RT-PCR的方法,从多头绦虫的成虫cDNA中分离到45mA。结果45M蛋白的高免血清可被细粒棘球绦虫不同发育阶段的天然抗原所识别,均在63kD处发生交叉反应;从多头绦虫的成虫cDNA中分离到45m基因的同源基因,命名为45mA（Gen-Bank号为EU326106）,45m和45mA的核酸序列和蛋白序列分别有86％和76％的同源性;45M和45MA蛋白与细粒棘球蚴的保护性蛋白Eg95有57％的氨基酸同源性。结论提示45m抗原分子在多头绦虫和细粒棘球绦虫的不同发育阶段均存在,为45M蛋白的免疫原性的分析提供了宝贵的资料。     

免疫组化法检测EgM蛋白免疫犬的肠系膜淋巴结抗体靶位点的探索

目的检测EgM蛋白免疫后的犬肠系膜淋巴结和感染细粒棘球绦虫后的犬肠系膜淋巴结上的IgG和特异性IgG抗体。方法用免疫组织化学方法检测仅EgM免疫犬肠系膜淋巴结、EgM蛋白免疫后感染原头蚴的犬肠系膜淋巴结、感染细粒棘球绦虫(原头蚴)的犬肠系膜淋巴结上的IgG。用细粒棘球绦虫虫体分泌表达的重组蛋白EgM制备的高免特异性抗体可引起免疫犬的特异性抗体反应。结果在EgM免疫犬和感染原头蚴的犬的肠系膜淋巴结检测出IgG。结论用EgM蛋白免疫犬后可以在其肠系膜淋巴结产生特异性抗体。     

细粒棘球绦虫抗氧化蛋白TPx的免疫定位

目的：研究抗重组细粒棘球绦虫抗氧化蛋白TPx（rEgTPx）多克隆抗体对天然EgTPx的结合活性，探讨EgTPx在原头蚴内的分布。方法：采集自然感染细粒棘球蚴的绵羊肝脏，在无菌条件下收集包囊内的原头蚴，经消化处理后制备石蜡切片。利用rEgTPx多克隆抗体，以间接免疫荧光法确定抗氧化蛋白EgTPx在原头蚴内的分布。结果：rEgTPx多克隆抗体能够特异性地结合天然EgTPx抗原表位，EgTPx广泛分布在原头蚴的体表皮层、皮下层和钙颗粒细胞内。结论：确定了EgTPx蛋白在细粒棘球绦虫原头蚴内的分布，为研究EgTPx在原头蚴发育的生物功能奠定基础。     

麝香保心丸治疗急性心肌梗死的临床观察

目的:观察麝香保心丸(HMP)对急性心肌梗死(AMI)急性期治疗和梗死后早期二级预防的作用.方法:急性心肌梗死患者50例随机分为HMP治疗组(Ⅰ组)和安慰剂对照组(Ⅱ组)观察治疗前后心室壁运动、心脏功能、左室重塑变化及严重心脏血管事件(MACE)和再住院(RH)的发生率.应用心脏彩色超声仪测定治疗前后室壁运动指数(RWNI),左室结构及心功能相关指标,采用双抗体夹心ABC-ELISA法测定细胞凋亡抑制因子(Fas/AP0-1).结果:HMP40mg日3次,口服3个月室壁运动指数RWNI明显改善(p＜0.05),左室收缩末期容量(LVESV)、左室舒张末期容量(LVEDV)明显下降(p＜0.01),左室射血分数(LVEF)明显升高(p＜0.01),左室舒张早期和左室舒张晚期血流峰值比(EP/AP)明显改善(p＜0.05),左室重塑受抑,球体指数(SI)无明显改变(p＞0.05),血清细胞凋亡抑制因子较对照组明显减少(p＜0.05),严重心血管事件和再住院发生率减少(p＜0.05或0.01).结论:AMI加用HMP治疗可明显减少心肌细胞凋亡、改善室壁运动指数、减少梗死面积、改善心脏功能、防治左心室重塑,减少严重心血管事件和再住院发生率,具有较高的临床安全性和顺应性,有益于AMI的急性期治疗和AMI后早期的二级预防.