日本血吸虫中国大陆株基因重组抗原Sj 22.6kDa的核苷酸序列分析

目的：对ｐＧＳｊ２４克隆化基因进行核苷酸序列分析，了解其编码蛋白的属性。方法：常规制备ｐＧＳｊ２４克隆化基因并重组入测序载体Ｍ１３ｍｐ１９，以ＤＹＥＰＲＩＭＥＲ荧光测序试剂盒进行核苷酸序列测定。分别以ＤＮＡＳＩＳ和ＧＯＬＤＫＥＹ软件对序列资料进行分析。结果：ｐＧＳｊ２４克隆化基因长８４０ｂｐ，含一开放阅读框，可编码一分子量为２２．６ｋＤａ的蛋白质。开读框上游和下游均有终止密码子。该基因与已发表的日本血吸虫２２．６ｋＤａ蛋白的编码基因同源性达９５％，编码区同源性达９９．７％。在该基因内有一段典型的ＥＦ－Ｈａｎｄ钙结合区序列，并有内质网导肽、微体导向信号等功能位点。预测该蛋白质内可能的抗原决定簇位置为第２９－３２、６３－６８和８７－１０１等氨基酸片段。结论：ｐＧＳｊ２４克隆化基因为日本血吸虫２２．６ｋＤａ抗原编码基因。     

日本血吸虫特异性IgE抗体相关肽表位的筛选与免疫学鉴定

目的　从噬菌体表面显示肽库筛选并鉴定日本血吸虫特异性IgE抗体相关表位。 方法用ABC 酶联免疫吸附 (ELISA)法检测日本血吸虫病流行区居民血清 15 0份 ,选择其中 15份具高滴度血吸虫特异性IgE抗体的血清 ,混合后经蛋白G柱亲和层析祛除IgG抗体 ,用于对 12肽的噬菌体表面显示肽库进行 5轮免疫亲和淘筛。从所获噬菌体克隆中挑取 35个克隆 ,经DNA序列测定 ,对各独立肽表位进行免疫学鉴定。结果　经 5轮筛选 ,DNA序列测定显示共有 4个独立噬菌体克隆 ,其中 phage 3和 phage 6有较多重复克隆存在 ,为优势克隆 ;Westernblot分析显示 ,筛库血清中特异性IgE抗体能有效识别各噬菌体克隆。分别用各克隆噬菌体免疫小鼠 ,均能诱导特异性IgE抗体产生。结论　从 12肽噬菌体表面显示肽库中成功筛选到日本血吸虫特异性IgE抗体相关肽表位。     

人乳头瘤病毒6b型早期蛋白E6和E7基因的克隆及表达

目的:从尖锐湿疣(CA)标本中克隆出人乳头瘤病毒6b型(HPV-6b)早期蛋白E6、E7基因,并进行序列分析比对及原核表达,为HPV感染的检测和基因工程疫苗研究奠定基础。方法:用PCR法,从CA标本中扩增HPV-6的E6、E7基因,构建pUCHPV-6E6、pUCHPV-6E7两个重组体,酶切鉴定及测序分析比对。经双酶切与表达载体pGEX-5X-1定向连接,构建pGEX-5X-l重组表达质粒,转入BL21大肠杆菌,IPTG诱导GST融合蛋白表达及Westernblot鉴定。结果:克隆出HPV-6b早期蛋白E6、E7基因,成功构建pUCmHPV-6bE6、pUCmHPV-6bE7重组质粒,克隆获得HPV-6bE6、E7基因与GenBank标准株序列完全相同,经双酶切定向克隆,成功构建重组表达质粒pGEX-5X-lHPV-6bE6和pGEX-5X-lHPV-6bE7,转入BL21大肠杆菌,高效表达GST融合蛋白。结论:本研究克隆出的HPV-6bE6、E7基因与标准株相同,HPV-6bE6、E7GST融合蛋白获得高效表达,为HPV-6bE6、E7基因表达产物的纯化、体外活性以及E6、E7为靶位的基因疫苗研究奠定基础。     

用噬菌体肽库筛选重组日本血吸虫线粒体相关蛋白的表位

目的：筛选和鉴定重组的日本血吸虫（中国大陆株）线粒体相关蛋白rSj38的表位。方法：用纯化的rSj338/26GST免疫家兔获得抗rSj338/26GST的多克隆抗体IgG，将抗体进一步纯化，获得抗rSj338单特异多克隆抗体IgG。用纯化抗rSj338抗体对噬菌体12肽库进行5轮免疫学筛选，挑取克隆。采用Western blot免疫识别，核苷酸序列测定分析其获得的表位并与rSj338/26GST进行同源性比较。将获得的不同表位的阳性克隆分别免疫小鼠，并采用Western blot及dot-ELISA方法筛选能刺激小鼠产生较高滴度抗rSj338抗体的阳性克隆，并将阳性噬菌体免疫的小鼠血清对纯化的rSj338/26GST,26GST，日本血吸虫成虫及虫卵抗原进行Western blot识别。结果：经5轮免疫学筛选后挑取的32个克隆，用Western blot方法30个克隆能被抗rSj338抗体识别，核苷酸序列分析发现共有11种表位，与rSj338无一级结构的同源性。经动物免疫初步实验筛选。共获得4个免疫原性较强的阳性克隆，其免疫鼠血清均可识别rSj338/26GST，日本血吸虫成虫及虫卵抗原。结论：获得了4种日本血吸虫中国大陆株线粒体相关蛋白rSj338的表位，均为模拟表位，这将为日本血吸虫病的疫苗研究开辟新的途径。     

日本血吸虫中国大陆株重组脂肪酸结合蛋白(sj-FABPc)的特性和抗原表位的分析

目的 了解重组的日本血吸虫中国大陆株脂肪酸结合蛋白（ｒＳｊ－ＦＡＢＰｃ）的特性及预测其抗原表位。方法 以ＰＣＲ方法从Ｓｊ－ｃＤＮＡ文库中扩增Ｓｊ－ＦＡＢＰｃ基因片段,并亚克隆于载体ｐＧＥＭ－Ｔ,对其核苷酸序列进行测定。以ＧＯＬＤＫＥＹ软件和Ｓｗｉｓｓ－Ｍｏｄｅｌ数据库分析Ｓｊ－ＦＡＢＰｃ的核苷酸序列和其编码的蛋白质特性,预测重组抗原的表位。结果 核酸序列分析证明,克隆基因确为Ｓｊ－ＦＡＢＰｃ,并由     

应用因特网对SARS病毒M蛋白B细胞抗原表位的预测

目的：预测SARS冠状病毒M蛋白的B细胞表位。方法：采用EMBOSS软件结合Hopp＆woods亲水性参数、Janin可及性参数、极性参数、柔韧性参数及二级结构方案对SARS冠状病毒M蛋白的B细胞表位进行了预测，并用吴玉章等已建立的B细胞表位预测方法进行评述。结果：SARS冠状病毒M蛋白B细胞识别的表位可能位于第3～13和153～166位氮基酸等区域内或附近，这2个被预测的表位均含有β—转角和无规卷曲结构。结论：该研究对应用合成肽抗原进行SARS早期诊断研究及相关抗体的制备具有重要指导意义。     

糖尿病的基因治疗技术:大鼠胰岛素原基因真核细胞表达质粒构建与鉴定

目的:构建大鼠胰岛素原基因的真核细胞表达质粒pCMV/proinsulin并进行序列测定。方法:实验选用雄性SD大鼠1只,从大鼠胰腺组织中提取总RNA,通过RT-PCR法获得胰岛素原基因cDNA全长序列,并采用现代分子生物学技术,借助真核细胞表达质粒pCMV-Scriptvector具有多克隆酶切位点的特点,选择适当的限制性酶切位点(EcoRⅠ和HindⅢ),并使大鼠胰岛素原基因cDNA两端带有相同的酶切位点,利用其黏性末端进行定向克隆,从而将大鼠胰岛素原基因准确地插入到表达质粒pCMV上。结果:经RT-PCR法扩增并通过DNA核酸序列测定获得大鼠胰岛素原基因。经PCR法及酶切法初步筛选阳性克隆重组子,并进一步进行DNA核酸序列测定(双脱氧末端终止法),确定其序列与目的基因序列完全一致。结论:成功构建重组质粒pCMV/proinsulin,为进一步进行胰岛素原基因转染糖尿病大鼠和非胰岛β细胞,使之产生胰岛素、建立类胰岛β细胞系的研究奠定了扎实的基础。     

使用微量乳胶凝集法诊断人体弓浆虫病

弓浆虫病的血清学诊断方法中最可靠的是颜料试验,但必须要活的弓浆虫和一些辅助条件,而且要求技术相当熟练,因而不适宜于检查大量标本。代替本法的多用血球凝集试验,但受试血清需先行灭活和吸收,为其缺点。以往采用的乳胶凝集反应方法虽简单,但其敏感性和特异性均不如其它方法。本研究的目的在于探讨采用微量试剂法的乳胶凝集反应能否用于人体弓浆虫病的诊断。     

日本血吸虫重组抗原基因的高效表达和特性鉴定

为了获得有效的保护性抗原分子，我们对已构建的日本血吸虫成虫ｃＤＮＡ库的免疫筛选中所获得的阳性克隆λＳｊ５１４的。ＤＮＡ插入片段进行ＰＣＲ扩增，扩增产物亚克隆入高表达载体ｐＧＥＸ－１λｔ，得到高效表达克隆ｐＧＳｊ２４。经诱导表达生产出约２０ｋＤａ的分离表达产物，该特异性蛋白可被日本血吸虫免疫血清、感染兔血清和病人血清特异地识别，而且具有较强的免疫原性，可刺激动物产生较强的抗体反应。     

日本血吸虫副肌球蛋白T细胞表位的预测和鉴定

目的鉴定日本血吸虫副肌球蛋白的T细胞表位。方法用SYFPEITHI软件预测日本血吸虫(中国大陆株)副肌球蛋白的T细胞表位，候选表位分别命名为P20、P21、P22、P23、P24。设计并合成候选表位的编码核苷酸，定向克隆入融合表达载体pET-32c( )，经酶切及测序鉴定出重组克隆。阳性克隆经IPTG诱导表达，表达产物以Ni^2 -NTA柱亲和层析及透析纯化。纯化后的硫氧还蛋白(Trx)融合蛋白体外刺激C3H／HeJ及C57BL／6小鼠腹股沟淋巴结或脾脏单个核细胞，^3H-TdR掺入法检测其增殖。结果候选表位中P20、P21、P22、P23能有效刺激C3H鼠致敏淋巴细胞细胞增殖，P20、P22能刺激C57鼠致敏淋巴细胞增殖。结论P20和P22可能是日本血吸虫副肌球蛋白的通用性T细胞表位。