人脑胶质瘤中IKKε的表达及其意义

目的探讨IKKε基因在人脑胶质瘤组织中的表达及其意义。方法收集具有明确病理分级的51新鲜胶质瘤标本,其中Ⅰ～Ⅱ级胶质瘤24例,Ⅲ～Ⅳ级胶质瘤27例,并取7例内减压去除的脑组织标本作为对照。采用实时定量PCR(Real-time PCR)和蛋白免疫印迹(Western blot)方法检测IKKεmRNA和蛋白水平的表达,免疫组化染色确定IKKε的细胞定位,研究IKKε蛋白表达与胶质瘤病理分级的关系。结果 IKKεmRNA水平(t=23.734,P0.05)和蛋白水平(掊2=12.583,P0.05)在人胶质瘤中的表达显著高于对照脑组织,在Ⅲ～Ⅳ级胶质瘤组的表达显著高于Ⅰ～Ⅱ级组(t=21.587,P0.05)。Western blot结果显示7例对照脑组织6例无IKKε表达(6/7),24例Ⅰ～Ⅱ级胶质瘤3例中/高表达,27例Ⅲ～Ⅳ级胶质瘤23例中/高表达。IKKε的表达与人脑胶质瘤病理分级呈正相关(r=0.513,P0.05)。免疫组化染色显示IKKε阳性反应物主要位于胞浆。结论IKKε在人脑胶质瘤中呈高表达,IKKε的表达与人脑胶质瘤的病理分级相关,可能与人脑胶质瘤的发生及恶性进展有关。     

敲低miR221/222上调PUMA促进胶质母细胞瘤U251细胞凋亡的体内研究

目的 探讨敲低miR-221/222表达上调PUMA对U251人脑胶质母细胞瘤凋亡的影响及其机制. 方法 5周龄BALB/c裸鼠左侧鼷部皮下接种1 mm3移植胶质瘤瘤块建立裸鼠移植瘤模型,1周后接受治疗(转染无义序列组、反义miR-221/222共转染组分别瘤内注射无义对照序列、反义miR-221/222寡核苷酸,对照组注射等量溶剂,每组8只).治疗开始至28 d观察肿瘤的生长情况,观察期结束时取肿瘤组织HE染色检测病理学改变;荧光原位杂交(FISH)、实时定量PCR检测肿瘤组织miR-221、miR-222的表达;TUNEL染色检测肿瘤细胞凋亡,免疫组化染色、Western blotting检测肿瘤组织凋亡相关蛋白PUMA、bax和bcl-2、p53的表达. 结果 治疗后6～28 d反义miR-221/222共转染组移植瘤的体积明显低于对照组和转染无义序列组,差异有统计学意义(P＜0.05);与转染无义序列组及对照组比较,反义miR-221/222共转染组肿瘤组织miR-221、miR-222 mRNA的表达水平下降;HE染色显示反义miR-221/222共转染组肿瘤组织异型性减低,新生血管数减少;与对照组和转染无义序列组比较,反义miR-221/222共转染组肿瘤组织的凋亡指数较高,差异有统计学意义(P＜0.05);免疫组化染色检测显示与对照组和转染无义序列组比较,反义miR-221/222共转染组PUMA、bax表达阳性率较高,bcl-2表达阳性率较低,差异有统计学意义(P＜0.05); Western blotting检测显示与对照组和转染无义序列组比较,反义miR-221/222共转染组肿瘤组织PUMA和bax蛋白表达升高,bcl-2表达下降,而p53表达无明显变化. 结论 反义miR-221/222治疗可通过上调PUMA蛋白表达来诱导U251胶质瘤细胞凋亡.     

改良Devine术矫正小儿隐匿性阴茎

目的 探讨小儿隐匿性阴茎的诊断和矫形效果。方法 采用改良的Devine术治疗小儿隐匿性阴茎20例。结果 术后所有患儿阴茎外观满意，伸直好，无并发症。结论 改良Devine术治疗小儿隐匿性阴茎疗效确切。     

miR-20a/106b调控NKG2D途径介导儿童型脑干胶质瘤免疫逃逸的实验研究

目的探讨miR-20a/106b在儿童脑干胶质瘤(BSG)恶性进展中的作用及其机制。方法回顾性纳入2012年1月至2017年12月天津市环湖医院(天津市脑系科中心医院)神经外科接受手术切除的13例儿童BSG患者和5例成人BSG患者。采用免疫组织化学染色法检测肿瘤组织标本中自然杀伤细胞2家族成员D(NKG2D)配体MICA的表达情况,采用生物信息学方法筛选出调控MICA的miRNA。应用人脑胶质瘤LN229和U251细胞株通过荧光素酶报告基因方法验证筛选出的miRNA与MICA的靶向调控关系,通过蛋白质免疫印迹(WB)实验检测miR-20a/106b转染LN229和U251细胞株后MICA的表达情况,通过乳酸脱氢酶(LDH)释放法检测免疫细胞对LN229细胞株的毒性能力。通过向去胸腺幼年(3周龄)和成年(10周龄)雄性SD大鼠脑桥区立体定向注射LN229细胞株的方法制备BSG幼鼠(J-rat)和成年鼠(A-rat)模型,并根据注射细胞株不同各分为3组,依次为J-rat组、J-rat-scr组、J-rat-miR-20a/106b-d组和A-rat组、A-rat-scr组、A-rat-miR-20a/106b-u组(每组各3只),通过免疫组织化学染色方法检测MICA的表达情况,采用MCID软件检测肿瘤的侵袭性,采用TUNEL法检测细胞凋亡。结果成人患者的MICA总阳性表达率较儿童患者高(分别为5/5、10/13,P<0.05)。检索结果显示,有23个可能调控MICA的microRNA,其中包括miR-20a和miR-106b。在LN229细胞株中,荧光素酶报告基因结果显示,转染pGL3-MICA-wt(野生型)质粒的荧光强度较对照组和转染pGL3-MICA-mut(突变型)质粒的强(均P<0.05);WB结果显示,与空白对照组和无义序列组比较,AS-miR-20a组、AS-miR-106b组及AS-miR-20a/106b组MICA的表达均增加(均P<0.05)。上述实验在U251细胞株得到相似的结果。不同效靶比(20∶1,10∶1,5∶1)情况下,AS-miR-20a/106b组LDH的活性高于对照组和AS-miR-20a/106b+MICA mAb组(均P<0.05),但后两组的差异无统计学意义(均P>0.05)。术后头颅MRI结果显示,3组幼鼠和3组成年鼠均成功制备脑干胶质瘤模型。MCID软件检测结果显示,J-rat-miR-20a/106b-d组I值较J-rat组、J-rat-scr组均降低(均P<0.05);A-rat-miR-20a/106b-u组I值较A-rat组、A-rat-scr组均增加(均P<0.05)。免疫组织化学染色结果显示,J-rat-miR-20a/106b-d组的MICA染色强度均较J-rat组和J-rat-scr组增加(均P<0.05),A-rat-miR-20a/106b-u组MICA的染色强度均较A-rat组和A-rat-scr组降低(均P<0.05)。体内凋亡实验显示,J-rat-miR-20a/106b-d组的细胞凋亡指数均较J-rat组和J-rat-scr组增加(均P<0.05),A-rat-miR-20a/106b-u组的细胞凋亡指数较A-rat组和A-rat-scr组均降低(均P<0.05)。结论miR-20a/106b通过NKG2D途经达到的免疫逃逸是导致儿童型BSG恶性度高的重要原因。     

白细胞介素18、单纯疱疹病毒-胸苷激酶基因联合修饰骨髓间充质干细胞治疗脑胶质瘤

目的了解骨髓间充质干细胞(bone marrow stromal cells,BMSCs)联合转染单纯疱疹病毒-胸苷激酶基因(HSV-tk)和白细胞介素18(interleukin-18,IL-18)后在荷瘤大鼠体内的治疗作用。方法提取1周龄大鼠骨髓培养大鼠骨髓间充质干细胞。骨髓间充质干细胞转染单纯疱疹病毒-胸苷激酶基因(BMSCs/tk)或白细胞介素18(BMSCs/IL-18)或联合转染单纯疱疹病毒-胸苷激酶基因、白细胞介素18(BMSCs/tk/IL-18),而后进行体内外试验检测其抗肿瘤作用。检测荷瘤鼠脾脏淋巴细胞免疫活性,采用TUNEL方法检测胶质瘤内的凋亡细胞,抗-CD34染色检测微血管密度(MVD),检测淋巴细胞的浸润,记录试验大鼠的生存期。结果骨髓间充质干细胞可稳定转染IL-18及tk基因,BMSCs/tk和BMSCs/IL-18/tk均显示了明显的旁观者效应,荷瘤鼠移植BMSCs/IL-18或BMSCs/IL-18/tk后,血清白细胞介素2和干扰素-γ浓度明显增高,并且接受移植的荷瘤鼠再次受到C6细胞冲击后可诱导快速的抗肿瘤免疫反应。微血管密度检测显示,BMSCs/IL-18(4.50±2.19)、BMSCs/tk/IL-18(3.65±2.13)与对照组(7.15±2.11)、PBS组(7.55±1.64)、BMSCs组(7.80±2.28)、BMSCs/tk组(7.65±1.84)比较有明显低的微血管密度(P0.05),通过TUNEL检测、浸润淋巴细胞计数、细胞因子浓度及荷瘤鼠生存期比较,BMSCs/IL-18/tk比BMSCs/IL-18或BMSCs/tk显示了更加明显的抗肿瘤作用,BMSCs/IL-18/tk组生存期明显延长。结论联合转染单纯疱疹病毒-胸苷激酶基因和白细胞介素18的骨髓间充质干细胞显示了明显的抗恶性胶质瘤作用,骨髓间充质干细胞可能成为一种理想的治疗颅内胶质瘤的基因治疗载体。     

大鼠骨髓间充质干细胞神经分化潜能的体内外研究

目的 体内外研究大鼠骨髓间充质于细胞向神经细胞分化的潜能.方法 从大鼠骨髓中分离培养得到的BMSCs传至5代后分为A组,无诱导剂组;B组,神经细胞诱导组;C组,成骨诱导组;D组,脂肪细胞诱导组.流式细胞仪检测细胞的免疫表型.A,B两组行神经细胞相关蛋白检测;C组行茜素红染色,D组行油红O染色.将Hoechst3258标记的第5代BMSCs立体定向植入(n=10只)大鼠顶叶皮质,4周后观测.结果 BMSCs表面CD29、CD44、CD90阳性,CD31、CD34、CD45阴性.在体外,A组细胞仅Nestin阳性,B组细胞Nestin、MAP2、NSE、GFAP均呈阳性,且形态类似神经细胞.C组经诱导后可见矿化结节.D组细胞浆内出现脂肪滴.大鼠脑内移植部位可见Hoechst3258染色阳性的BMSCs.并呈Nestin,MAP2、NSE、GFAP阳性.结论 体外BMSCs易于分离、培养及扩增.BMSCs具有多向分化潜能,可通过诱导向脂肪、成骨及神经细胞分化.在体外能自发表达神经干细胞相关蛋白,在大鼠脑内可自发向神经细胞分化.     

靶向表皮生长因子受体psiRNA抑制人脑胶质瘤细胞系U251生长的体外研究

目的探讨靶向表皮生长因子受体(EGFR)RNA干扰(RNAi)技术抑制人脑胶质瘤细胞系U251EGFR表达后,在体外对细胞增殖活性和侵袭能力的抑制作用。方法应用流式细胞术、Annexin V法、MTT法、Matrigel细胞外基质生长实验和Transwell细胞侵袭实验评价由脂质体Lipofectamine 2000介导转染的人脑胶质瘤细胞系U251转染前后细胞增殖活性和侵袭能力的变化;Western blotting检测EGFR和PI3K/Akt信号转导通路中相关蛋白质的表达水平。结果与对照组和psiRNA-scr组比较,psiRNA-EGFR组EGFR以及PI3K/Akt信号转导通路中相关蛋白质表达水平降低(均P=0.000)。转染后,psiRNA-EGFR组细胞阻滞于G0和G1期,S期细胞数目减少(均P=0.000);其细胞凋亡率为(9.60±0.26)%,高于对照组和psiRNA-scr组(均P=0.000);自培养第2天其细胞增殖速率即呈下降趋势,且低于对照组和psiRNA-scr组(均P=0.001)。结论靶向表皮生长因子受体RNAi技术可以序列特异性地抑制人脑胶质瘤细胞系U251细胞表皮生长因子受体表达,在体外对U251细胞生长具有明显抑制作用。靶向表皮生长因子受体psiRNA基因治疗可能成为脑胶质瘤治疗的新策略。     

尿道综合征的病理表现和病因探讨(附20例报告)

女性尿道综合征是泌尿科常见疾病。患者有尿频、尿急、尿疼和尿道烧灼感反复发作,但尿常规正常,中段尿培养阴性,统称为尿道综合征。近年研究表明,本征并非一种单独疾病,而是不同原因所引起的多种疾病所共同的症状群。其病因复杂,至今尚未彻底阐明。我院自1982年以来对20例因尿道综合征作了尿道前庭移植术的患者进行了尿道口组织病理检查,现报告如下。试图从     

腺病毒介导的靶向P85和Akt1短发夹RNA对人胃腺癌细胞生长抑制作用的研究

目的 构建靶向P85和蛋白激酶B1(PKB1/Akt1)的短发夹RNA(shRNA)腺病毒载体,研究其对人胃腺癌细胞SGC-7901生长的抑制效果.方法 构建腺病毒载体rAd5-P+A,体外转染SGC-7901细胞后,以实时定量PCR和Western blot分别检测P85和Akt1的mRNA和蛋白质的表达.以噻唑蓝比色分析法(MTT法)和流式细胞法评价转染后胃癌细胞的增殖活性.构建裸鼠皮下荷瘤模型进一步观察rAd5-P+A对SGC-7901细胞生长的抑制效果,并应用原位末端标记技术(TUNEL法)检测肿瘤细胞的凋亡情况.结果 成功构建的rAd5-P+A重组腺病毒载体转染SGC-7901细胞后可显著抑制p85和Akt1的mRNA表达,而P85和Aktl蛋白表达量在转染48 h、72 h后分别下调57.5%、63.7%和67.8%、75.6%,与空白对照组和通用腺病毒对照(rAd5-HK)组相比,差异具有统计学意义(P=0.005,P=0.003).与空白对照组和rAd5-HK组相比,SGC-7901细胞的增殖活性在rAd5-P+A转染后第2天明显下降(P<0.001),且rAd5-P+A转染组进入S期的细胞数减少了5.9%～7.1%,而进入G0/G1期的细胞增加了12.1%～13.7%.裸鼠皮下荷瘤模型治疗实验也显示,rAd5-P+A可抑制胃癌细胞的生长,诱导细胞的凋亡.结论 腺病毒介导的靶向P85和Akt1的shRNA可抑制人胃腺癌细胞的生长,这可能为胃腺癌靶向性联合基因治疗提供新的策略.     

Ku蛋白的晶体结构功能与肿瘤放射治疗

Ku蛋白是一种DNA双链断裂修复结合蛋白,可以与多种DNA末端相结合。Ku蛋白由于其对DNA末端的识别保护作用和对整个非同源末端连接修复复合体的成核作用而成为NHEJ有效性的主要决定因素,决定着细胞的损伤修复能力。此外在包括端粒区的维持、抗凋亡、肿瘤抑制以及基因转录的调控等方面都发挥着重要作用。抑制肿瘤细胞中Ku蛋白的表达,可以有效减少其放疗后DNA双链断裂的修复,从而达到提高其放射敏感性的目的。