靶向表皮生长因子受体的shRNA抑制U251胶质瘤生长的实验研究

目的探讨靶向表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)的RNA干涉(RNAi)技术抑制恶性胶质瘤体外细胞系U251的EGFR表达后,在体内外对U251细胞生长抑制作用。方法在人EGFR开放阅读框的细胞内区酪氨酸激酶结构域选择1个siRNA靶序列、进行短发夹RNA(shRNA)表达载体psiRNA-2400的构建,并以含有随机序列的psiRNA-scr表达质粒为对照进行了脂质体介导的U251人脑恶性胶质瘤细胞系表达。应用RT-PCR检测EGFR表达水平,应用MTT法、流式细胞术和Matrigel基质生长实验评价肿瘤细胞转染前后的生物学行为。进一步应用裸鼠皮下荷瘤模型观察脂质体介导shRNA基因治疗对U251细胞生长抑制作用。对肿瘤组织应用免疫组化的方法进行EGFR、PCNA和GFAP表达比较。结果脂质体介导、靶向EGFR的shRNA可显著抑制U251细胞ECFR表达,MTT法分析显示psiRNA-2400转染组细胞生长抑制率为68%;与对照组和psiRNA-scr转染组比较,细胞周期分析结果表明psiRNA-2400转染组G_0～G_1期细胞数没有明显变化,进入S期的细胞数较对照组减少了12.7%～13%,而进入G_2期细胞则增加了10.5%～11.7%。Matrigel基质生长实验显示对照组和psiRNA-scr转染组细胞呈正常形态贴壁生长,而psiRNA-2400转染组细胞不能贴壁生长,呈团块状簇集生长。裸鼠皮下荷瘤模型实验显示psiRNA-2400显著抑制皮下肿瘤生长,组织病理学分析显示治疗组EGFR表达下降、PCNA标记指数降低而GFAP表达上调。结论靶向EGFR的RNAi技术可以显著抑制U251细胞的EGFR表达,在体内外对U251细胞生长均产生明显抑制作用。因此,shRNA表达质粒介导的基因治疗可以成为胶质瘤靶向性EGFR治疗的新策略。     

靶向AKT1和COX-2的RNAi抑制U251胶质瘤细胞侵袭的体外实验

目的应用RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术敲低恶性胶质瘤细胞系U251中AKT1和COX-2表达后,在体外对细胞侵袭转移的抑制作用,初步探讨其可能的作用机制。方法构建重组腺病毒载体rAd5-A-C同时搭载靶向AKT1和COX-2的shRNA干扰序列,将其转染至恶性胶质瘤细胞系U251细胞。Realtime PCR检测RNAi后目的基因mRNA的表达水平,Western Blot检测目的基因及MMP-2、MMP-9、TIMP-2的表达情况。酶联免疫吸附试验检测转染前后分泌到细胞外的MMP-2和MMP-9的浓度变化。划痕实验和Transwell实验评价肿瘤细胞转染前后的细胞侵袭能力的变化。结果rAd5-A-C转染组AKT1和COX-2的mRNA和蛋白表达均明显抑制;MMP-2、MMP-9表达下调,TIMP-2表达则上调。ELISA检测胞外MMP-2、MMP-9浓度明显减低;划痕实验显示细胞转移运动能力明显减弱,Transwell体外侵袭实验结果显示穿过细胞数明显减低(P0.001)。结论重组腺病毒介导的RNAi技术可以序列特异性地抑制U251细胞AKT1和COX-2的表达,在体外对U251细胞侵袭转移产生明显抑制作用,可能成为恶性胶质瘤治疗的新策略。     

脑胶质瘤信号转导通路研究进展

脑胶质瘤是临床最为常见的原发性颅内肿瘤,约占颅内肿瘤的46%,占成年人全身肿瘤的2%;恶性胶质瘤的发病率为(5～8)/100万,在1998年     

反义miR-21通过RECK抑制胶质瘤细胞侵袭性生长的体内外研究

目的 探讨胶质瘤细胞LN229中RECK作为miR-21的调控靶点,在胶质瘤侵袭性生长中的作用.方法 将反义miR-21(AS-miR-21)寡核苷酸转染至人脑胶质瘤细胞LN229中.Real-time PCR检测LN229细胞中miR-21的表达量.荧光素酶实验检测miR-21对RECK的调控关系.Transwell实验评价LN229细胞侵袭能力的变化,应用Western blot检测细胞内MMP2/9和RECK蛋白水平的变化,ELISA实验检测培养基中活性MMP2/9的表达量,动物实验评价体内条件下肿瘤侵袭性的变化.结果 Real-time PCR显示转染组中miR-21的表达量与对照组相比下调60%.荧光素酶实验证明RECK是miR-21的靶点.Transwell实验证实胶质瘤细胞侵袭能力下降,Western blot和ELISA实验证实MMP2/9表达降低,动物实验及免疫荧光反映肿瘤侵袭性生长受抑制.结论 反义miR-21通过上调RECK的表达而抑制恶性胶质瘤细胞的侵袭性生长.

Abstract：

Objective To investigate the regulation of miR - 21 on invasion growth of human glioma cells by RECK.Method The human glioma LN229 cells were transfected with AS - miR - 21 or scrambled sequences by Lipofectamine2000.Real time PCR was conducted to detect the expression of miR-21.Luciferase experiment was performed to detect the relationship between miR-21 and RECK.The expression of RECK was evaluated by Western blot.The invasion ability was evaluated by transwell assay and subcutaneous models.Western Blot, ELISA and immunofluorescence were used to estimate the changes of MMP2/9.Results The expression of miR - 21 in LN229 cells decreased after transfection with AS-miR-21. It was proved that RECK was a direct target of miR -21 by luciferase experiment.Meanwhile, the high expression of RECK protein in AS - miR -21 group conformed its important function in this mechanism.Transwell assay demonstrated decreased invasion capability of LN229 cell lines transfected with AS- miR- 21.Western blot, ELISA, and immunofluorescence demonstrated the levels of MMP2/9 were down -regulated in AS -miR -21 group compared with control and scrambled group.Conclusions AS - miR -21 could depress the invasion of glioma cells owing to up - regulating the level of RECK which could inhibit MMP2/9 activities both in vitro and vivo.     

长链非编码RNA与肿瘤

已经有越来越多的证据表明基因组的非编码序列的转录对于生命活动具有重要意义。相对于蛋白编码序列以及各种小分子RNA,长链非编码RNA（lncRNA）的研究还仅仅处于起步阶段,其功能与调控机制仍有待进一步研究。本文对目前关于lncRNA与肿瘤关系的研究进展进行综述,认为lncRNA可能为肿瘤诊断和治疗提供新依据和靶点。     

白藜芦醇抑制胶质瘤细胞增殖的体内外实验研究

目的探讨白藜芦醇(Res)对C6胶质瘤细胞增殖的抑制作用及其机制。方法将不同浓度Res作用于C6大鼠胶质瘤细胞系,MTT法检测细胞增殖率,流式细胞术检测细胞周期及凋亡,蛋白印迹(Western blot)检测Res处理前后C6细胞表皮生长因子受体(EGFR)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达;免疫组化分析基质金属蛋白酶(MMP)-9、转录核因子-κB(NF-κB)的表达。应用立体定向术建立大鼠动物模型,将20只大鼠分为对照组和治疗组,治疗组8只以8 mg·kg-1·d-1的剂量饲喂,2只以16 mg·kg-1·d-1的剂量饲喂,观察动物一般表现及生存期。MRI动态监测肿瘤大小,脑标本进行病理组织学及相关指标检测。结果在体外Res可明显抑制C6胶质瘤细胞生长,细胞周期被阻滞在S期,诱导肿瘤细胞凋亡,Res可延长荷瘤SD大鼠生存期,免疫组化检测EGFR、MMP-9、NF-κB表达降低,而GFAP表达升高。结论Res可抑制胶质瘤细胞增殖,延长荷瘤动物生存期,具有潜在临床应用价值。     

丝／苏氨酸激酶通路在胶质瘤中的研究进展

丝／苏氨酸激酶(AKT)通路处于转导生长因子向细胞核内传递信号的中心环节，其功能涉及细胞周期调控、凋亡的启动、血管生成、端粒酶活性和细胞侵袭性等诸多方面。随着研究工作的不断深入，AKT通路在胶质瘤的研究中凸现出日益重要的作用。综述AKT功能调控、在胶质瘤研究中的研究进展以及在胶质瘤治疗中的潜在作用。     

反义miR-21抑制异种移植U251人脑胶质瘤生长的体内研究

目的 探讨敲低miR-21表达抑制裸鼠荷皮下U251人腩胶质瘤生长的疗效和机制. 方法 原位注射miR-21反义寡聚核苷酸(AS.miR-21)治疗裸鼠皮下荷U251人脑胶质瘤.定时测量肿瘤大小评估原位注射AS-miR-21治疗效果:使用Real time PCR和原位杂交方法鉴定治疗后miR-21表达水平下调;采用HE染色和免疫组织化学染色(PCNA、PTEN、MMPs、和Septins)评价治疗后肿瘤牛物学性状改变;TUNEL法检测肿瘤细胞凋亡. 结果 肿瘤生长曲线显示AS-miR-21治疗组肿瘤生长速度及体积小于空白对照与无义序列治疗组(F=52.458,P=0.000);Real-time PCR法:AS-miR-21治疗组miR-21表达下调为对照组的0.018±0.009:原位杂交显示AS-miR-21治疗组miR-21表达水平较对照与无义序列治疗组下调:组织病理学检测表明AS-miR-21治疗后肿瘤恶性度降低;TUNEL法检测可见AS-miR-21治疗组细胞凋亡数显著高于对照与无义序列治疗组(F=141.021,P=0.000).结论 以miR-21作为靶点抑制异种移植U251人脑胶质瘤生长,miR-21可能通过上调抑癌基因PTEN抑制胶质瘤的生长,可以作为人脑胶质瘤基因治疗的侯选靶点.     

RNAi下调PIK3 CB表达抑制U251胶质瘤细胞生长的体内外研究

目的 探讨应用RNAi技术靶向磷酸肌醇酯-3-激酶β催化亚单位(PIK3CB)抑制恶性胶质瘤细胞系U251的PIK3CB表达后在体内外对U251细胞生长抑制作用.方法 将短发夹RNA(shRNA)表达载体psiRNA-PIK3CB进行脂质体介导的U251人脑恶性胶质瘤细胞系表达,检测细胞转染前后的细胞增殖能力和凋亡的变化.应用裸鼠皮下荷瘤模型观察脂质体介导shRNA基因治疗对U251细胞生长抑制作用,对肿瘤组织应用免疫荧光双染色和免疫组化的方法分析结果.结果 靶向PIK3CB的shRNA转染后U251细胞生长受到抑制,细胞周期出现G2/M阻滞,细胞明显凋亡.裸鼠皮下荷瘤模型实验显示psiRNA-PIK3CB显著抑制皮下肿瘤生长(P＜0.01).结论 靶向PIK3CB的shRNA基因治疗可以成为胶质瘤治疗的新策略.     

miR-451对胶质瘤细胞株A172生物学特征的影响

目的 研究miR-451对胶质瘤细胞株A172生物学特征的影响.方法 合成寡核苷酸miR-451拟似物(miR-451 mimics)转染胶质瘤细胞以上调miR-451的表达,real-time PCR检测转染后miR-451的表达,Western印迹法检测目标蛋白表达,应用流式细胞术、MTT法评价细胞生长和增殖的生物学特征变化.结果 转染miR-451 mimics后,real-time PCR检测提示miR-451表达升高,Western blot结果显示癌基因C-myc表达下降＞63.6%,细胞周期正向调节因子CDK2、CDK4、Cyclin D1和Cyclin E表达下降;细胞周期分析表明miR-451 mimics组进入G0/G1期的细胞数较对照组增多达17.4%,出现G0/G1期阻滞;MTT法分析显示miR-451 mimics组细胞生长受抑.结论 miR-451可以抑制人脑胶质瘤细胞生长和增殖能力,具有抑瘤作用.