Notch信号通路介导血小板源生长因子AA诱导的血管平滑肌细胞增殖和迁移

目的探讨Notch信号通路在血小板源生长因子AA(PDGF-AA)诱导血管平滑肌细胞(VSMC)增殖和迁移中的作用及机制。方法脱臼处死1~2月龄雄性SD大鼠,无菌取腹主动脉,剥弃外膜及去除内皮后,贴块法培养VSMC,α-SM-actin染色鉴定。实验分为四组:对照组、γ-secretase抑制剂组(DAPT组)、PDGF-AA组和PDGFAA+γ-secretase抑制剂组(PDGF-AA+DAPT组)。实时荧光定量PCR(Real-time q PCR)检测Notch信号分子mRNA表达;Cell Titer96 Aqueous One Solution试剂盒检测细胞增殖活性;采用细胞划痕实验检测VSMC的迁移能力。结果腹主动脉VSMC表达Notch信号通路Jagged1、Jagged2、Notch1~3等几种主要的配体及受体;PDGF-AA刺激24h和48 h后分别导致Jagged2和Jagged1 mRNA表达显著增强(P0.01,n=4);与0 h相比,PDGF-AA刺激72 h后,Notch1、Notch3 mRNA表达显著增高(P0.01,n=4),而刺激24 h后Notch2 mRNA表达显著降低。PDGF-AA显著促进HES1(P0.05,n=4)、HEY2(P0.05,n=4)和转录因子Rbp-jКmRNA(P0.05,n=4)表达,DAPT抑制PDGF-AA介导的HES1、HEY2 mRNA表达增强(P0.01,n=4),但是进一步促进PDGF-AA诱导的Rbp-jКmRNA表达(P0.05,n=4);PDGF-AA刺激促进VSMC增殖(P0.01,n=5)和减少划痕余留面积(P0.01,n=4),两种效应均可被DAPT显著阻抑(P0.01,n=4)。结论 PDGF-AA调节了VSMC Notch信号分子表达,PDGF-AA部分通过激活Notch信号通路调节VSMC的增殖和迁移。     

小鼠脐带间充质干细胞的体外诱导分化

目的分离扩增小鼠脐带间充质干细胞（mouse umbilical cord mesenchymal stem cells,mUCMSCs）探讨其是否可诱导成软骨、脂肪和成骨细胞。方法 通过贴壁培养法将mUCMSCs体外分离、扩增、纯化,倒置显微镜下观察细胞的形态特征,运用流式细胞仪检测分析细胞的抗原标志表达进行鉴定。运用诱导培养液对分离的mUCMSCs分别定向诱导培养为软骨、脂肪和成骨细胞。结果 运用组织贴块培养法可从新鲜脐带中分离到贴壁生长的成纤维样细胞,这些细胞高表达CD29、CD90和CD105,低表达CD34。成软骨诱导后阿新兰染色呈蓝色;成脂诱导后油红O染色,出现红色脂滴;茜红素染色成骨诱导的mUCMSC,可见红色结节。结论 贴壁培养法分离培养所获得的mUCMSCs在体外可诱导分化为软骨、脂肪和成骨细胞。     

骨髓造血干细胞与肝再生的相关性研究

感染、中毒等引起的急慢性肝损伤治疗是临床医学领域的世界性难题,干细胞的研究为肝再生提供了全新的思路.肝再生的细胞学机制涉及肝细胞、肝干细胞和骨髓干细胞等. 新近发现骨髓造血干细胞具有向肝细胞转化的潜能,可以在体内外被诱导分化为肝样细胞,移植到肝损伤动物体内可以修复肝组织损伤,这为肝再生研究开辟了新的途径.对骨髓造血干细胞参与肝细胞再生的深入研究,有可能找到肝损伤治疗的有效措施.     

胎儿肌肉来源细胞的分离及其成肌分化研究

目的 观察胎儿肌肉来源细胞(flMDC)体外成肌分化能力以及在mdx鼠体内再生抗肌营养不良蛋白.方法 使用舍10％新生牛血清的DMEM/F12培养液,采用预贴壁方法从胎儿肌肉组织中分离fMDC.采用免疫染色鉴定肌肉特异标志的表达.肌内注射fMDC到6.5 Gy照射3d后的mdx小鼠股直肌,1个月后采用免疫荧光染色法和RT-PCR方法检测人抗肌营养不良蛋白和基因的表达.结果 采用预贴壁方法可从胎儿肌肉组织中分离到贴壁生长、梭型的flMDC.可在fMDC的一些长纤维细胞包浆中检测到MHC的表达,在一些细胞胞核中检测到成肌素的表达.可在注射fMDC的mdx小鼠肌肉中检测到人抗肌营养不良蛋白和基因的表达.结论 fMDC中存在MHC和成肌素的阳性表达,注射fMDC到照射过的mdx小鼠体内可以再生抗肌营养不良蛋白表达.     

食蟹猴脐带间充质干细胞的分离与鉴定

目的建立食蟹猴脐带间充质干细胞的分离培养方法。方法新鲜食蟹猴脐带剪碎为糊状,用含10%胎牛血清的DMEM/F12培养液培养,观察细胞形态特征,流式细胞技术分析细胞抗原标志的表达,并检测其体外多向分化潜能。结果运用组织贴块法可以从新鲜脐带中分离到贴壁生长、阳性表达CD29、CD44、CD90的成纤维细胞样细胞。这些细胞在体外诱导培养后可分别检测到脂滴、骨和软骨细胞。结论运用组织贴块培养法可用含10%胎牛血清的DMEM/F12培养液从食蟹猴脐带中分离到间充质干细胞。     

过表达Jagged1促老龄大鼠来源内皮祖细胞增殖和迁移

目的 探讨过表达Jagged1对老龄大鼠来源内皮祖细胞增殖和迁移能力的影响.方法 PBS冲洗1～2月龄和19～ 26月龄SD大鼠股骨和胫骨骨髓,Ficoll密度梯度离心法分离单个核细胞,应用含10％ FBS的DMEM/F12培养基差速贴壁法进行体外培养,以Dil-ac-LDL与FITC-UEA-1荧光双染和vWF免疫组织化学染色进行鉴定.实验分为四组:对照组(未进行基因转染的老龄大鼠内皮祖细胞组)、PIRES2-EGFP转染组、PIRES2-EGFP-Jagged1转染组和未转染的年轻大鼠来源内皮祖细胞组.荧光显微镜下计数GFP表达细胞数并计算转染效率;免疫荧光、RT-PCR和Western blot检测Jagged1 mRNA和蛋白表达;Transwell培养和MTT法分别检测细胞迁移和增殖能力.结果 免疫组织化学、RT-PCR和Western blot检测均显示转染后Jagged1显著增高,PIRES2-EGFP-Jagged1转染组mRNA和蛋白表达均较对照组显著增强(P＜0.01);与对照组相比,过表达Jagged1显著增强老龄大鼠来源内皮祖细胞迁移和增殖能力(P ＜0.05或P＜0.01).结论 过表达Jagged1增强老龄大鼠来源内皮祖细胞增殖和迁移能力.     

羟基磷灰石/魔芋葡甘聚糖复合材料的制备和表征*★

目的：制备羟基磷灰石/魔芋葡甘聚糖复合材料，分析两者间的结合机制以及羟基磷灰石和魔芋葡甘聚糖复合性能最佳时的工艺条件。 方法：实验于2007-03/06在昆明理工大学组织工程支架与多孔催化载体实验室完成。通过共沉淀法制备羟基磷灰石(hydroxyapatite，HAP)/魔芋葡甘聚糖(konjac glucomannan，KGM)复合材料。对不同pH样品进行X射线衍射仪物相分析。KBr压片法制样，傅里叶转换红外光谱仪测定样品的傅里叶转换红外光谱。样品表面喷金后，用扫描电镜观察样品的形貌和微观结构及进行电子能谱分析。 结果：复合材料中的无机相为部分碳酸根取代的呈弱结晶状态的HAP, KGM分子链上乙酰基中的羰基是HAP的成核位点。pH值是影响HAP和KGM间交互作用的关键因素，HAP和KGM的原料比对复合性能有明显影响。当pH=9.0和10.7、原料比为w（HAP/KGM）=30/70时，HAP和KGM复合良好。 结论：实验制备的HAP/KGM复合材料是一种潜在的骨组织工程支架材料，pH值和HAP/KGM原料比是影响HAP和KGM 复合性能的重要影响因素。     

猕猴骨髓干细胞动员后外周血干细胞、免疫细胞亚群及细胞因子变化

目的:观察GM-CSF动员猕猴骨髓干细胞后外周血干细胞、免疫细胞亚群和细胞因子含量的动态变化,为临床干细胞动员及用于治疗疾病提供参考依据.方法:健康猕猴连续5 d,皮下注射GM-CSF 8 μg/(kg·d),分别于0、2、4、6、8、10 d采集外周血,血细胞分析仪计数白细胞(WBC)总数、淋巴细胞和中性粒细胞比例,流式细胞术(FCM)测定CD34 、CD133 、CD3 、CD4 、CD8 、CD56 细胞比例,酶联免疫分析法测定血清TNF-α、IL-1β、IL-2含量.结果:WBC、中性粒细胞、CD34 、CD133 细胞数量和比例均同步升高(P＜0.01),到动员第6天时达到高峰,细胞数量分别为正常水平的6.4、9.1、117和163.3倍,其中CD34 、CD133 第8天时恢复正常,而WBC、中性粒细胞仍高于正常水平(P＜0.05).CD3 、CD4 、CD8 、CD56 细胞的数量增加,细胞数在第6天时分别为动员前的4.1、4.0、2.9和4.3倍,但比例下降(P＜0.01),到第6天达到最低(P＜0.001),随后逐渐升高至正常以上水平并持续至第10天(P＜0.05).TNF-α、IL-1β、IL-2浓度于动员后6 d内明显升高(P＜0.01),其中TNF-α、IL-1β浓度至8 d恢复正常(P＞0.05),IL-2浓度升高幅度较大并至少持续至第10天(P＜0.01).结论:连续5 d动员猕猴骨髓干细胞可使外周血中CD34 、CD133 细胞比率短暂升高,WBC、中性粒细胞比例持续升高,使CD3 、CD4 、CD8 、CD56 细胞绝对数增加,TNF-α、IL-1β、IL-2浓度升高,表明GM-CSF动员猕猴骨髓干细胞可在细胞和免疫调节因子水平提高免疫功能.     

顺铂对人肺腺癌细胞SLC-89作用的机理探讨

目的 观察顺铂对SLC-89细胞增殖生长、端粒酶活性、细胞周期、p53、bcl-2及增殖细胞核抗原(PCNA)表达的影响，探讨顺铂抗癌作用的机理。方法 以不同浓度的顺铂作用于培养的SLC-89细胞72h，运用MTT法测定细胞增殖，端粒酶重复序列扩增酶联免疫吸附法(TRAP-ELISA)检测细胞端粒酶活性以及流式细胞术观察细胞周期的变化和p53、bcl-2及PCNA的表达。结果 顺铂能显著抑制SLC-89细胞的生长，IC50为18．47mg／L。顺铂能以浓度依赖方式下调SLC-89细胞端粒酶活性，减少S期细胞而阻滞细胞于G0／G1期，降低bcl-2和PCNA的表达，同时诱导p53的表达。结论 顺铂能显著抑制SLC-89细胞生长增殖、改变细胞周期分布、降低端粒酶活性及bcl-2与PCNA的表达，并诱导p53的表达，这可能是顺铂抗癌作用的重要机理。     

兔肝纤维化模型建立与自体骨髓干细胞移植的疗效

背景：国内外已基于不同研究需要建立了多种肝纤维化动物模型方法，多采用大鼠为实验对象，但大鼠血容量少，不利于生化指标的检测。目的：探讨容易重复而且可靠的肝纤维化模型制作方法，并通过骨髓干细胞自体肝门静脉移植给予治疗，判定其疗效和安全性。设计、时间及地点：随机对照动物实验，于2004—09／2006-03在解放军昆明总医院干细胞与组织工程研究中心完成。材料：肝功能检查正常的健康日本大耳白兔38只，体质量2．0-2．5kg，随机分为2组：健康对照组8只，模型组30只。方法：连续12周皮下注射硫代乙酰胺诱导兔肝纤维化，将造模成功的17只大鼠分为移植组与空白对照组。采集移植组兔骨髓，分离获得骨髓单个核细胞，加入肝细胞生长因子和粒单细胞集落刺激因子对骨髓干细胞进行诱导分化72h，经肝门静脉自体移植。主要观察指标：移植后4周通过病理与生化指标分析诱导后骨髓干细胞对肝纤维化的治疗作用。结果：注射硫代乙酰胺12周时，病理切片显示肝小叶结构破坏，肝索排列紊乱，肝细胞脂肪变性，有少许坏死，间质纤维组织增生，有部分伸入小叶，有炎性细胞浸润，为肝纤维化症状。经兔肝门静脉移植骨髓干细胞4周后，总蛋白、清蛋白和白球蛋白比值均有所提高，总胆红素、直接胆红素、谷丙转氨酶和谷草转氨酶均有所降低，空白对照组也有改善，移植组肝纤维化病变较空白对照组改善程度明显。结论：皮下注射硫代乙酰胺能成功诱导兔肝纤维化，且致死率低，容易重复；骨髓干细胞移植有治疗肝纤维化的作用，有助于肝组织结构恢复和改善肝功能。