产肠毒素大肠杆菌定居因子I基因克隆与表达

目的:在大肠杆菌DH5α中表达产肠毒素大肠杆菌(Enterotoxigenio escherichia coli,ETEC)定居因子CFA/I,检测重组表达的ETEC CFA/I.方法:以质粒pBV220为基础,构建pBV220-CFA/I重组载体,表达产物用SDS-PAGE鉴定,免疫原性实验验证.结果:成功构建了pBV220-CFA/I重组载体,表达产物的分子量与天然蛋白相同,动物免疫试验表明重组菌具有免疫原性.结论:CFA/I基因的成功克隆为今后的ETEC CFA/I候选疫苗研制奠定了基础.     

双歧杆菌的选择计数培养基

双歧杆菌因其重要的生理功能已广泛应用于食品与保健品生产，成为微生态及食品学界研究的热点。迄今为止，对双歧杆菌的研究尤其是分子生物学方面的进展异常缓慢，主要原因之一是其自身很难分离和培养，这就要求有一个能选择性促进双歧杆菌生长的培养基。现就近几年的研究进展作一综述。     

仙台病毒复制序列对未成熟树突状细胞蛋白表达的影响

目的 研究仙台病毒载体复制序列对未成熟树突状细胞(dendritic cells,DC)蛋白质表达的影响,为联合运用二者进行基因治疗提供依据.方法 提取去除仙台病毒复制序列载体(Sev/△F)、完全序列载体(SeV)转染未成熟DC的总蛋白,定量.双向凝胶电泳分离蛋白质组分,胶体银染显色,PDQuest进行图像分析后选取差异点,胶内酶解后MALDI-TOF MS进行肽指纹图谱鉴定.结果 图像分析结果显示,Sev/△F感染后的DC明显比SeV感染后的DC表达蛋白点多,其中有不少蛋白表达量也明显上调.结论 仙台病毒载体感染未成熟DC后引起蛋白表达的减少,这与SeV的复制序列有关.     

人MCHR2真核表达载体的构建及稳定转染细胞系的建立

目的:构建人MCHR2真核表达载体,转染HEK293细胞,建立稳定转染细胞系. 方法:采用PCR方法,以人胎脑cDNA文库为模板扩增人MCHR2基因的全长cDNA编码区序列,DNA重组技术将其定向插入到真核表达载体pcDNA3.1( ),经酶切和PCR鉴定后,脂质体转染法转染HEK293细胞,通过G418选择培养,建立稳定转染细胞系,RT-PCR,Western Blot及免疫荧光法检测MCHR2的表达. 结果:成功构建了pcDNA3.1-MCHR2真核表达载体并已稳定转入HEK293细胞,建立了稳定转染细胞系,成功地表达目的基因. 结论:稳定转染细胞系的建立和基因表达为进一步研究MCHR2的功能提供了良好的实验基础.     

沉默HPV16 E6基因对人宫颈癌裸鼠移植瘤的抑制作用

目的 采用RNA干扰抑制人宫颈癌CaSki细胞裸鼠移植瘤中人乳头瘤病毒(human papillomavirus-16,HPV16)E6基因的表达,观察对裸鼠移植瘤的抑制作用.方法 将HPV16 E6特异性的小干扰RNA(small interference RNA,siRNA)真核表达载体转染到人宫颈癌细胞株CaSki细胞中,经G418筛选,RT-PCR检测E6基因的表达;将细胞接种到BALB/c裸鼠背部皮下,同时将该质粒注射到人宫颈癌CaSki细胞移植瘤的裸鼠中,观察肿瘤出现时间及体积变化;观察肿瘤组织的病理改变.结果 成功筛选到持续表达E6 siRNA的CaSki细胞,经RT-PCR检测该细胞中HPV16 E6基因表达降低;裸鼠成瘤实验结果显示,处理后的CaSki细胞成瘤能力明显降低,抑瘤率为71.4%;注射质粒进行基因治疗后,裸鼠肿瘤生长受到抑制,肿瘤的体积与质量明显低于CaSki细胞组,差异具有显著性(P＜0.05).病理检查结果显示,经pGensil-CH2处理的肿瘤生长不佳,细胞分裂像少见,组织内有较多坏死区域.结论 沉默CaSki细胞中HPV16 E6基因的表达能明显降低宫癌细胞的成瘤作用.     

表皮生长因子受体靶向纳米载体荷载c-erbB2反义寡脱氧核苷酸对人乳腺癌SK-BR3细胞的摄取与滞留*

背景：结合肿瘤的分子靶向技术和纳米技术,制备出一种新的具有靶向作用的纳米载体,以达到对肿瘤更好靶向作用的目的。 目的：制备表皮生长因子偶联牛血清白蛋白纳米载体,联合核素标记的c-erbB2 反义寡脱氧核苷酸,体外观察人乳腺癌SK-BR3细胞对其摄取情况。 设计、时间及地点：对比观察实验,于2006-09/2008-03在重庆医科大学生物化学和分子生物学教研室,重庆医科大学分子医学与肿瘤研究中心,重庆医科大学放射医学教研室完成。 材料：牛血清白蛋白(生物技术级)由美国Amresco公司提供,表皮生长因子由英国PeproTech EC LTD提供,125I由成都中核高通同位素股份有限公司提供,寡脱氧核苷酸由上海生工生物工程技术服务有限公司提供。 方法：采用超声乳化-化学交联及羧和反应制备表皮生长因子偶联白蛋白靶向纳米载体,通过核素标记示踪技术检测表皮生长因子偶联白蛋白靶向纳米载体的相关性质。 主要观察指标：测量表皮生长因子靶向纳米载体荷载c-erbB2反义寡脱氧核苷酸的载药量、包封率及释药率,人乳腺癌SK-BR3细胞对表皮生长因子靶向纳米载体的摄取率及滞留率。 结果：表皮生长因子靶向纳米载体包载125I标记的反义寡脱氧核苷酸组的摄取率及滞留率高于正义寡脱氧核苷酸组和无义寡脱氧核苷酸组。同时c-erbB2寡脱氧核苷酸使用纳米载体荷载组的摄取率及滞留率均高于未使用纳米载体组,差异有显著性意义(P < 0.05)。 结论：125I标记的表皮生长因子靶向纳米载体能够提高乳腺癌SK-BR3细胞对c-erbB2反义寡脱氧核苷酸的摄取和滞留,能达到更好的靶向作用。     

PsL5F诱导人未分化甲状腺癌FRO细胞凋亡与细胞内ROS水平对JNK信号通路的影响

目的 研究半边旗5F(Pteris semipnnata L 5F,PsL5F)对人未分化甲状腺癌FRO细胞的凋亡诱导及其与细胞内活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平升高和丝裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinases,MAPKs)激活的关系.方法 MTT法测定PsL5F对FRO细胞的生长抑制作用;流式细胞术与Annexin V-FITC/PI标记法联用检测PsL5F对FRO细胞的凋亡诱导;用ROS特异反应试剂CM-H2DCFDA标记在流式细胞仪上分析PsL5F对FRO细胞内ROS水平的影响;Western blot法分析PsL5F处理对FRO细胞ERK、JNK和p38MAPK磷酸化水平的影响.结果 PsL5F对FRO细胞具有显著的生长抑制作用,且呈剂量-时间依赖性;在PsL5F 100 mg/L浓度下,磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine,PS)外翻细胞的比例呈时间依赖性逐渐增加;用PsL5F处理FRO细胞,在1 h时细胞内ROS水平就表现出明显的升高,GSH可抑制PsL5F诱导的细胞内ROS水平升高和细胞凋亡到对照水平;PsL5F处理可使FRO细胞ERK、JNK和p38MAPK磷酸化而被激活,JNK抑制剂Dicumarol可减轻PsL5F诱导的细胞凋亡,ERK和p38MAPK的抑制剂PD098059和SB203580加剧PsL5F诱导的细胞凋亡.结论 PsL5F对FRO细胞的生长抑制作用是通过诱导细胞凋亡进行的;细胞内ROS水平升高起到了非常重要的作用;PsL5F处理可导致FRO细胞MAPKs信号通路激活,其中JNK信号通路是促凋亡信号,而ERK和p38MAPK作为生存信号被激活来对抗PsL5F诱导的细胞凋亡.     

人MCPH1基因shRNA逆转录病毒载体的构建及鉴定

目的:建立逆转录病毒介导的MCPH1基因RNA干扰表达体系并观察其在宫颈癌细胞(HeLa)中对MCPH1表达的影响。方法: 将人MCPH1基因RNA干扰双链DNA片段重组到逆转录病毒质粒pSilencer5.1-H1 Retro中,构建携带人MCPH1基因RNA干扰逆转录病毒载体pSiRNA-MCPH1,经PT67细胞包装后,产生的重组逆转录病毒感染宫颈癌细胞株HeLa细胞,并用嘌呤霉素筛选产生稳定的细胞克隆,用RT-PCR和Western印迹检测细胞中MCPH1 mRNA和蛋白表达的变化。结果:重组pSiRNA-MCPH1质粒经测序鉴定正确;重组逆转录病毒感染HeLa细胞后用嘌呤霉素筛选出稳定的细胞克隆;RT-PCR和Western印迹检测人MCPH1 mRNA和蛋白表达水平明显低于阴性对照组和未干扰组。结论:携带人MCPH1基因RNA干扰双链DNA片段的逆转录病毒感染HeLa细胞后能明显抑制MCPH1 mRNA和蛋白表达,为进一步研究MCPH1在宫颈癌中的作用奠定了基础。     

指骨骨骺兴趣区域的自动提取方法

背景:在骨龄自动化评定中,许多方法对骨骺兴趣区域的提取不够理想。目的:通过k余弦算法定位出手指骨的特征点,解决对骨骺兴趣区域的提取的困难和提取方法的局限性。方法:提取指骨兴趣区域,并用各向异性扩散方法进行滤波,然后根据骨龄指骨的图像数据进行统计,寻找出定位指骨中心点的方法,通过3次多项式对中心点线进行拟合,定位出指骨的中心轴,在此基础上提取出指骨骨骺兴趣区域。结果与结论:用该方法定位出的指骨中心轴比较真实的反映指骨骨架,在此基础上能提取出指骨骨骺兴趣区域,成功率>95%,并能运用到后续对指骨骨骺兴趣区域相关的评定中。     

病毒性肝炎中一氧化氮合酶调节的分子生物学机制

研究发现一氧化氮(NO)参与肝细胞的多项生理功能的调节,参与各种肝病的病理过程。一氧化氮具有潜在的抗病毒活性,一氧化氮合酶(NOs)作为产生一氧化氮的限速酶,不但参与一氧化氮的生成,还与一氧化氮的各种生理功能密切相关。了解与阐明肝细胞中一氧化氮合酶的分子生物学作用调节机制,有利于揭示病毒性肝炎的发病机理