人MDC1基因shRNA反转录病毒载体的构建及鉴定

目的 建立反转录病毒介导的MDC1基因RNA干扰表达体系并观察其在官颈癌细胞(HeLa)中对MDC1表达的影响.方法 将人MDC1基因的RNA干扰双链DNA片段重组到反转录病毒质粒pSilencer5.1-H1 Retro中,构建携带人MDC1基因的RNA干扰反转录病毒载体psiRNA-MDC1.经PT67细胞包装后,产生的莺组反转录病毒感染宫颈癌细胞株HeLa细胞,并用嘌呤霉素筛选稳定的细胞克隆.采用RT-PCR和Western blotting检测细胞中MDC1 mRNA和蛋白表达的变化.结果 重组psiRNA-MDC1质粒经测序鉴定正确;重组反转录病毒感染HeLa细胞后用嘌呤霉素筛选出稳定的细胞克隆;RT-PCR和Western blotting检测人MDC1 mRNA和蛋白表达水平明显低于阴性对照组和未十扰组.结论 携带人MDC1基因RNA干扰双链DNA片段的反转录病毒感染HeLa细胞后能明显抑制MDC1 mRNA和蛋白表达,为进一步研究MDC1在宫颈癌中的作用奠定了基础.     

建设特色实验室，为教学改革服务

对近几年创建特色实验室的一些经验进行探讨，促进实验室的建设与发展，更好的为教学改革工作服务。     

RNAI沉默Grp94基因对人食管癌ECA109细胞迁移及侵袭能力的影响

目的 探讨RNAI沉默Grp94基因表达对人食管癌ECA109细胞迁移及侵袭能力的影响和可能机制.方法 设计、合成靶向Grp94基因的siRNA基因片段,应用脂质体包埋转染食管癌ECA109细胞,采用Real-time PCR和Western blot法分别检测转染后的细胞内Grp94、基质金属蛋白酶MMP2及MMP9的表达,采用Transwell实验检测沉默Grp94基因对细胞迁移及侵袭能力的影响.结果 SiGrp94组中Grp94mRNA和蛋白水平显著下调(P＜0.01),MMP2、MMP9表达明显下调(P＜0.05);SiGrp94组细胞迁移及侵袭能力明显降低,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 沉默Grp94基因可明显抑制ECA109细胞的迁移及侵袭能力,Grp94可能通过影响MMP2、MMP9参与其中.     

IL-18在毕赤酵母中的表达和纯化

目的:探索人IL-18成熟蛋白(mhIL-18)在毕赤酵母中的高效表达. 方法:采用SOEing及不对称PCR方法扩增出mhIL-18基因并构建融合型表达载体pPIC9-IL-18-Intein,转化入毕赤酵母GS115,甲醇诱导表达,运用SDS-PAGE和Western Blot分析重组蛋白的表达,并经亲和层析后用MTT法检测表达的mhIL-18生物活性. 结果:成功构建载体并转化入毕赤酵母,经甲醇诱导,重组的GS115可分泌mhIL-18,其表达在96 h时达高峰,分泌量可达100 mg/L. 亲和层析后的mhIL-18纯度可达95%,并具有显著的IL-18的生物学活性. 结论:在毕赤酵母中成功表达具有显著生物学活性的mhIL-18.     

稳定、高效表达人MCHR2的SHG-44细胞系的建立

目的:构建黑色素浓集激素受体2(MCHR2)真核表达载体pcDNA3.1( )MCHR2,转染SHG-44细胞,建立稳定、高效表达人MCHR2的SHG-44细胞系.方法:PCR法从人胎脑cDNA文库扩增MCHR2全长cDNA片段.用基因重组方法将其克隆到pcDNA3.1( ),构建真核表达载体pcDNA3.1( )MCHR2,并用LipofectamineTM转染到SHG-44细胞,通过G418筛选,建立稳定表达MCHR2的SHG-44细胞系,用RT-PCR、Western印迹及免疫荧光法检测MCHR2的表达.结果:扩增出MCHR2的全长cDNA)成功构建pcDNA3.1( )MCHR2;RT-PCR、Western印迹及免疫荧光法检测到MCHR2的表达,提示成功建立了稳定、高表达MCHR2的SHG-44细胞株.结论:MCHR2-SHG-44细胞株的建立为进一步研究MCHR2的功能奠定了良好的实验基础.     

丙型肝炎病毒核心蛋白上调诱导型一氧化氮合酶基因启动子的转录活性

目的 探讨丙型肝炎病毒（HCV）核心（core）蛋白对诱导型一氧化氮合酶（iNOS）基因启动子转录的激活作用。方法 利用生物信息学技术确定iNOS基因的启动子区域（iNOSp），聚合酶链反应（PCR）扩增iNOSp的DNA，克隆至真核报告载体pCAT3-Basic中，构建pCAT3-iNOSp报告载体；以该质粒转染正常人肝细胞LO2，用酶联免疫吸附法（ELISA）检测氯霉素乙酰转移酶（CAT）的表达活性；并与HCV核心蛋白的真核表达载体pcDNA3．1（-）-core共转染LO2细胞，用ELISA法检测CAT的表达活性。结果 成功获得iNOS基因启动子的正确克隆，pCAT3-iNOSp和pcDNA3．1（-）core瞬时共转染LO2细胞时，报告基因表达载体中的SV40病毒的即刻早期启动子的转录活性明显提高，CAT表达活性是pCAT3-Basic空载体的11倍，是pCAT3-iNOSp的6倍，重复试验得到了相似的结果。结论 成功克隆的iNOS启动子有转录活性；HCV核心蛋白具有对iNOS基因启动子的反式激活作用。HCV核心蛋白在细胞内的表达对于iNOS基因反式激活在HCV感染相关的慢性肝脏疾病的发病过程中具有重要意义。     

小鼠骨髓来源未成熟树突状细胞蛋白表达的分析

目的 利用双向电泳和质谱技术对小鼠骨髓来源未成熟树突状细胞(dendritic cells,DC)表达的蛋白质进行分析.方法 IL-4和GM-CSF诱导未成熟DC的分化,提取细胞总蛋白,定量.双向凝胶电泳分离蛋白质组分,胶体银染显色,PDQuest进行图像分析后选取蛋白点,胶内酶解后MALDI-TOF MS进行肽指纹图...     

真核表达载体pEGFP-N1-MKRN1的构建及其在Siha细胞中的表达

目的：构建真核表达载体pEGFP-N1-MKRN1并稳定转染人宫颈癌细胞系Siha细胞,检测MKRN1表达情况及对细胞增殖和凋亡的影响.方法：用RT-PCR技术从人胚肾细胞株HEK293细胞中获得MKRN1的cDNA并将其插入表达载体pEGFP-N1中;构建的重组质粒经脂质体介导转染Siha细胞;Western Blot鉴定MKRN1在Siha细胞中的稳定表达.结果：RT-PCR成功地扩增出一条约1477 bp的片段,经限制性内切酶酶切分析和DNA序列测定证实目的基因已插入重组质粒,荧光显微镜下观察到稳定转染的细胞发出较强绿色荧光,Western Blot证明人MKRN1能以融合蛋白的形式在Si-ha细胞中稳定表达.结论：成功构建了真核表达载体pEGFP-N1-MKRN1,获得了稳定表达人MKRN1基因的Siha细胞克隆,为进一步研究人MKRN1的功能及其与细胞增殖及凋亡的关系提供了实验基础和重要的细胞模型.     

生物化学实验教学改革初探

对近年来国内生物化学实验教学改革的现状进行了回顾，并以此为基础，结合生物化学实验教学中存在的问题，对生物化学实验教学的内容、实验考核办法等进行了初步改革和小范围试点，取得了良好的效果，为进一步建立更为完善的面向21世纪的医学生物化学实验教学新体系奠定了良好的基础。     

仙台病毒载体对未成熟树突状细胞蛋白表达的影响

目的:研究仙台病毒载体对未成熟树突状细胞(DC)蛋白质表达的影响. 方法:提取转染仙台病毒载体的树突状细胞和对照细胞的总蛋白,定量. 双向凝胶电泳分离蛋白质组分,胶体银染显色,PDQuest进行图像分析后选取差异点,胶内酶解后MALDI-TOF MS进行肽指纹图谱鉴定. 结果:图像分析结果显示,处理组2-DE图缺少了40个以上的蛋白点,对其中明显没有表达的5个蛋白点进行了鉴定. 结论:仙台病毒载体感染未成熟树突状细胞可引起蛋白表达的减少.