激素性股骨头坏死骨髓基质干细胞增殖活性的检测

目的检测皮质类固醇性股骨头坏死患者股骨干骺端骨髓基质干细胞的数量与增殖活性，为建立自体骨髓干细胞移植治疗股骨头坏死的合理性寻求证据。方法2005年2月至5月18例皮质类固醇性股骨头坏死的患者（ARCO分期Ⅱ，ⅢA期），男7例，女11例。对照组：无股骨头坏死，无激素应用的拟行人工关节置换的股骨颈骨折患者11例，男3例，女8例。用密度梯度离心法分离骨髓基质干细胞，再经贴壁筛选法筛选，对第3代骨髓基质干细胞，用四甲基偶氮唑蓝（MTF）法、流式细胞仪法测定细胞生长增殖水平及细胞周期。结果MTF结果显示对照组的hMSCs增殖能力明显比实验组强。流式细胞仪测定的细胞周期结果显示，股骨头坏死组G0／G1细胞比例明显高，而S＋G2／M期细胞比例低，PI值较对照组降低，两者差异有显著性意义（P〈0．05）。结论皮质类固醇性骨坏死的修复慢可能与患者股骨干近端骨髓基质干细胞增殖活性下降有关。皮质类固醇可能是通过降低了股骨头骨髓基质干细胞的增殖活性或增殖分化能力及改变其分化方向而引起骨坏死的。     

补肾强督方对强直性脊柱炎患者外周血单个核细胞产生MMP-9和TIMP-1的影响

目的：为探讨基质金属蛋白酶在强直性脊柱炎炎性骨破坏中的作用和补肾强督方治疗强直性脊柱炎的作用机制,比较强直性脊柱炎患者外周血单个核细胞（PBMC）产生基质金属蛋白酶9（MMP-9）及基质金属蛋白酶组织抑制因子1（TIMP-1）与健康对照者之间的差别,并研究补肾强督方治疗前后两者的变化。方法：2005年3月至2006年3月活动期强直性脊柱炎患者30例,其中男27例,女3例;年龄16～45岁,平均（30．8±8．8）岁;病程0．5-10年。经补肾强督方治疗3个月后,做自身前后对照,并设立健康对照组20例,常规分离血清和PBMC,将PBMC用PHA／PMA刺激后收集上清,应用RT-PCR检测PBMC的MMP-9和TIMP-1的mRNA表达水平,应用ELISA检测血清和细胞上清中MMP-9和TIMP-的含量。结果：与健康对照组相比,患者治疗前血清中MMP-9和TIMP—1浓度明显升高,患者治疗后与治疗前相比MMP-9和TIMP-1浓度显著降低：经PHA／PMA刺激后,患者治疗前的PBMC表达MMP-9和TIMP-1mRNA水平明显上调,细胞上清液中MMP-9和TIMP-1量明显升高,与健康对照组相比差异有统计学意义。患者治疗后PBMC表达MMP-9和TIMP-1mRNA水平明显下调,细胞上清液中MMP-9和TIMP-1含量均显著下降,与治疗前相比差异有统计学意义。结论：强直性脊柱炎活动期患者的PBMC表达和释放MMP-9和TIMP—1增强：补肾强督方可以显著降低强直性脊柱炎活动期患者MMP-9和TIMP-1的产生。     

体外血脑屏障模型的建立与鉴定

目的应用原代分离培养BALB／c小鼠脑微血管内皮细胞（brain microvascular endothelial cells，BMVEC）建立体外血脑屏障模型，探讨跨血脑屏障（blood brain barrier，BBB）电阻与屏障渗透功能的动态关系以及最佳构建条件。方法用酶消化、机械分离结合密度离心的方法得到原代BALB／c小鼠脑血管内皮细胞，通过培养在具有特殊质材和孔径的Transwell小室上建立BBB体外实验模型，采用倒置显微镜、电镜观察细胞形态结构和生长规律，紧密连接ZO-1蛋白免疫组化检测，比较血脑屏障形成前后膜两侧电阻动态变化与1H葡萄糖通透性的关系等方法，探讨血脑屏障模型的建立及生长特性。结果BMVEC培养至汇合后具有典型的“铺路石”样外观；扫描电镜显示细胞形成致密单层，透射电镜、ZO-1蛋白免疫组化证实细胞问形成光滑、连续、高密度的紧密连接；1H葡萄糖的通透量与实时电阻呈负相关，内皮细胞电阻随着通透性的增加而降低，通透率最低时跨细胞电阻为（346±10）Ω／cm2。结论建立的BBB体外模型在形态学、电阻和通透性方面具备了BBB的基本特性。     

动力相关蛋白-1参与糖皮质激素诱导的胰岛β细胞凋亡

目的探讨动力相关蛋白-1（DRP-1）对糖皮质激素诱导的胰岛13细胞凋亡的影响。方法采用地塞米松（Dex）处理大鼠胰岛13细胞系INS-1细胞,通过亚G1（Sub-G1）法检测细胞凋亡,Westernblotting检测DRP-1的表达。利用四环素诱导表达系统在INS-1细胞构建可诱导表达野生型DRP-1（DRP-1wt）基因和突变型DRP-1（DRP-1 k38A）基因的稳转细胞系,并用细胞免疫荧光和Westernblotting验证强力霉素（Dox）对转染基因的可诱导性。采用TUNEL法分析在Dex处理情况下,DRP-1wt基因或DRP．1k38A基因表达对Dex诱导的胰岛B细胞凋亡的影响,并同时测定相应细胞凋亡蛋白酶Caspase-3活性及细胞内活性氧（ROS）的变化情况。多组间均数比较采用单因素方差分析,组间两两比较采用t检验。结果不同浓度Dex处理组细胞凋亡率[（15．7±4．2）％、（30．4±3．3）％、（61．6±5．4）％]明显高于未处理组[（3．3±1．3）％,t=6．44、14．07、30．26,均P〈0．05];200nmol／LDex处理24、48及96h后细胞凋亡率[（10．6±1．2）％、（15．1±4．6）％、（42．6±9．8）％]明显高于处理0h组[（2．4±1．3）％,t=2．99、4．63、14．66,均P〈0．05]。Westernblotting显示Dex可诱导胰岛β细胞DRP-1基因的表达。DRP-1wt基因表达能够显著促进Dex诱导的β细胞凋亡[（53．8±7．2）％比（16．2±3．2）％,t=10．02,P〈0．05],而DRP-1k38A基因表达反而抑制Dex诱导的B细胞凋亡[（6．2±1．1）％比（14．5±1．8）％,t=10．63,P〈0．05]。DRP-1wt基因表达能够促进Dex诱导的caspase-3活化[（1979±132）比（921±182）,t=11．13,P〈0．05]及ROS产生[（772±62）比（290±56）,t=13．66,P〈0．05],而DRP-1k38A基因表达反而抑制了Dex诱导的caspase-3活化[（506±47）比（681±44）,t=5．25,P〈0．05]及ROS产生[（235±14）比（309±44）,t=3．86,P〈0．05]。结论DRP-1参与了糖皮质激素诱导的胰岛β细胞凋亡。     

微血管内皮细胞的分离、纯化和功能特性

近年来的研究表明,微血管内皮细胞在形态、表型和功能等方面都不同于大血管内皮细胞,因此,采用微血管内皮细胞,而不是脐静脉内皮细胞来研究发生于组织器官水平的病变已经成为一种共识。然而,由于细胞分离培养技术的限制,微血管内皮的研究在我国还是一个薄弱的研究领域。近年来随着微血管内皮细胞分离、纯化、培养技术的提高,各种不同组织器官的微血管内皮细胞相继培养成功。利用体外培养的微血管内皮细胞作为细胞模型来研究各种疾病的发病机制已经成为医学研究的重要手段。本文回顾了近年来的相关文献,就微血管内皮细胞的分离培养、鉴定及不同组织器官微血管内皮细胞的功能特性作一简要综述。     

比较肿瘤坏死因子α和内毒素对人脑微血管内皮细胞凝血和纤溶活性的影响

目的:比较肿瘤坏死因子α(TNF-α)和内毒素脂多糖(LPS)对人脑微血管内皮细胞(HBMVECs)凝血和纤溶活性的影响.方法:从人脑组织分离、纯化和培养HBMVECs,通过细胞免疫荧光染色、流式细胞术和电子显微镜对HBMVECs进行鉴定.检测TNF-α和LPS刺激前后HBMVECs凝血纤溶活性变化:一期凝同法检测凝血活性(PCA);酶联免疫吸附试验(ELISA)和实时荧光定量聚合酶链反应检测细胞组织因子(TF)、血栓调节蛋白(TM)、组织纤溶酶原激活剂(t-PA)、纤溶酶原激活物抑制剂-1(PAI-1)的水平.结果:分离、纯化的HBMVECs表达内皮细胞典型的标志分子vWF、CD31,并具有摄取乙酰化低密度脂蛋白的能力.LPS和TNF-α促进HBMVECs的凝血活性,上调PCA和TF的产生.抑制抗凝血活性,下调TM的表达;并明显促进纤溶活性t-PA和PAI-1的表达.通过比较PCA/TM发现,TNF-α对HBMVECs凝血活性的影响明显强于LPS.结论:TNF-α在感染性中枢神经系统疾病中可能是导致脑微血管内皮细胞功能障碍的主要因素之一.     

诱导干细胞分化的胰岛细胞形成胰岛样结构的实验研究

目的建立一种体外诱导干细胞分化的胰岛细胞形成胰岛样结构的技术方法。方法体外诱导人胚胎胰腺干细胞分化为胰岛细胞,将胰岛细胞制备成浓度分别为1×10^4／ml、3×10^4／ml、1×10^5／ml、3×10^5／ml（1×10^4／ml、3×10^4／ml、1×10^5／ml、3×10^5／ml组）单细胞悬液,在含有细胞外基质（ECM）的培养基中悬浮培养24h以诱导形成胰岛样结构,在荧光体视显微镜下观察胰岛样结构的形态和大小;采用免疫荧光染色方法检测胰岛样结构中ECM成分及其细胞组成与定位。将胰岛样结构分别在含5．6和30．0mmol／L葡萄糖的培养基中体外培养2h,采用放射免疫法测定上清中胰岛素水平。建立糖尿病大鼠模型,经门静脉将胰岛样结构移植至大鼠肝脏,移植后连续3d经鼠尾静脉检测血糖水平。结果90％人胚胎胰腺干细胞分化的胰岛细胞形成了胰岛样结构,其包膜、大小均与天然人胰岛组织结构相似;以形成直径150μm大小胰岛样结构的比例为标准,比较各组细胞浓度与胰岛样结构形成率的关系,结果显示分别与1×10^4／ml、3×10^4／ml、3×10^5／ml组（25．0％±2．5％、28．0％±3．0％、21．5％±2．5％）相比,1×10^5／ml组胰岛样结构形成率最佳（36．5％±4．0％,均P〈0．01）。胰岛样结构包膜上含有与天然人胰岛组织类似的ECM成分,且其中含有胰岛素、胰高血糖素和C-肽阳性细胞,其细胞比例与分布均与天然人胰岛组织类似。30．0mmol／L高糖浓度刺激后胰岛样结构胰岛素释放水平[（110±12）μIU／ml]较5．6mmol／L基础糖浓度[（59．5±8．0）pIU／ml]明显增加（P〈0,01）,胰岛样结构移植后糖尿病大鼠血糖水平较移植前均明显降低（P〈0．01）。结论本研究建立的技术方法可以将干细胞分化的胰岛细胞在体外大量、快速、高效地诱导形成具有功能的胰岛样结构。     

共接种淋巴管内皮细胞对乳腺癌细胞和骨肉瘤细胞在裸鼠体内生长和转移的影响

目的分析淋巴管生成对肿瘤生长和转移的影响。方法从人淋巴结中分离纯化淋巴管内皮细胞(HLyECs),将人乳腺癌细胞系和人骨肉瘤细胞系分别单独或与HLyECs共同接种于裸鼠皮下,比较肿瘤生长和肺转移的差别。用伊文氏蓝显示瘤周淋巴管;用人和小鼠PDPN的免疫组织化学显示肿瘤组织中的淋巴管。用MTT法分析淋巴管内皮细胞的增殖。结果与单纯接种组相比,共接种HLyECs促进乳腺癌细胞的生长和转移,瘤周和瘤内淋巴管密度增加(P<0.01),存在人和鼠PDPN阳性的淋巴管;而共接种HLyECs对骨肉瘤的生长和转移无影响,未见瘤内和瘤周淋巴管。与骨肉瘤细胞相比,乳腺癌细胞的条件培养基明显促进淋巴管内皮细胞增殖(P<0.01)。结论共接种淋巴管内皮细胞可以促进乳腺癌细胞的生长及癌组织中淋巴管生成。     

清开灵有效组分透过体外模拟血脑屏障的研究

目的检测清开灵有效组分在体外模拟血脑屏障中的透过率.方法应用脑微血管内皮细胞单层培养模型体外模拟血脑屏障,用高效液相色谱-质谱(LC/MS)分析方法,检测清开灵有效组分栀子苷、黄芩苷、牛胆酸、猪去氧胆酸、去氧胆酸在24h内的透过率.结果透过率从高到低依次为栀子苷、牛胆酸、猪去氧胆酸和去氧胆酸.在滤液中未检测到黄芩苷.结论清开灵有效组分在体外模拟血脑屏障中有较高的透过率,其透过机制和药理作用值得进一步研究.     

人海绵状血管瘤动物模型的建立和治疗药物的筛选

 目的 建立人海绵状血管瘤的动物模型，并用于药物筛选。方法 用荆豆凝集素包被的免疫磁珠分离和纯化人海绵状血管瘤内皮细胞（HCAEC）。将HCAEC（2.5×10⁶个）与人肝癌细胞Bel-7402（5×10⁵个）混合接种于裸鼠皮下，建立海绵状血管瘤的动物模型。通过绿色荧光蛋白示踪和组织学检查分析血管瘤中内皮细胞的来源和血管瘤的病理特征。另外，应用血管瘤内皮细胞和血管瘤动物模型筛选血管瘤的治疗药物。结果 HCAEC与Bel-7402细胞共移植于裸鼠皮下后7～9 d即可见接种局部形成血管瘤样结构。组织学检查显示血管瘤模型的组织学特征与人的海绵状血管瘤非常相似。细胞绿色荧光蛋白示踪显示绿色荧光蛋白存在于血管瘤的管壁，表明这些细胞来源于接种的HCAEC。药物筛选发现876-3，一种从中药中提取的单体，体外明显抑制HCAEC增殖，体内对血管瘤具有良好治疗作用。结论 HCAEC与肝癌细胞共移植在裸鼠皮下可以形成人源化血管瘤动物模型，这种血管瘤动物模型可以用于治疗药物的筛选。