胰岛移植治疗糖尿病的进展和有待解决的问题

 摘要 糖尿病是严重危害人类健康的疾病之一，已经成为继心脑血管疾病和肿瘤之后的人类健康第三大杀手。目前全世界的糖尿病患者总数已经超过 2 亿，并且以每年 200 万人的速度增加。我国糖尿病的患者总数已超过 6000 万，仅次于印度列世界第 2 位。糖尿病患者由于胰岛素产生障碍或胰岛素不能发挥生理作用而引起糖代谢紊乱，导致血管病变，可发生肢体坏死、失明和肾功能衰竭等一系列严重的并发症。采用胰岛素治疗虽然在一定程度上能够改善患者的糖代谢紊乱，然而并不能有效地防止或逆转糖尿病引起的微血管病变及其并发症。因此，寻找新的糖尿病治疗手段一直是医学研究的前沿课题。......     

人胚胎主动脉血管内皮祖细胞的分离、培养及鉴定

目的研究人胚胎血管内皮祖细胞(EPCs)分离、扩增及鉴定的方法,并评价其分化成血管内皮细胞的能力,为人胚胎血管来源EPCs作为干细胞技术治疗疾病的细胞材料提供依据。方法从14周龄流产人胚胎主动脉中应用胶原酶消化法分离获得EPCs,用含有碱性成纤维细胞生长因子、表皮生长因子和白血病抑制因子的低血清培养基体外扩增培养EPCs。分离培养的EPCs鉴定采用细胞免疫荧光染色、RT-PCR及流式细胞术,检测EPCs细胞的特异标志CD133、CD34和血管内皮细胞生长因子受体2(VEGFR2)。培养的EPCs应用VEGF进行诱导分化,并评价其分化成为血管内皮细胞的能力。结果分离的人胚胎主动脉EPCs细胞表达EPCs的标志分子CD133、CD34和VEGFR2。EPCs在体外特定低血清培养条件下表现很强的增殖能力。培养的EPCs细胞经过VEGF诱导后,细胞表达CD133明显降低,表达vWF、CD31和ELAM-1增强,并且体外成管能力和摄取Ac-LDL能力增强,表明细胞分化成为血管内皮细胞。结论人胚胎早期主动脉的EPCs具有很好的体外自我更新能力和分化成为血管内皮细胞的潜能,可作为EPCs治疗疾病的细胞材料。     

三七总皂苷对铝暴露脑微血管内皮细胞胞质紧密黏连蛋白1表达的影响

目的从血脑屏障的角度探讨三七总皂苷对铝暴露脑微血管内皮细胞胞质紧密黏连蛋白1（zonulaoccludens-1,ZO-1）表达的影响,初步揭示三七总皂苷抗老年痴呆的可能靶点及机制。方法采用脑微血管内皮细胞系Balb/c,以含20%胎牛血清和100 mg/L生长因子的DMEM培养基培养,随机分为正常组、模型组、铝螯合剂组及三七总皂苷低、中、高剂量组,经铝暴露24 h后,分别以荧光实时定量PCR和Western blot的方法测定ZO-1的基因转录和蛋白表达水平,观察不同剂量三七总皂苷对ZO-1表达的影响。结果与正常组相比,铝暴露24 h可使脑微血管内皮细胞ZO-1的转录及表达明显减少（P〈0.01）。与模型组比较,三七总皂苷高剂量组能显著增加ZO-1的基因转录水平（P〈0.05）,中、高剂量组能显著提高ZO-1的蛋白表达（P〈0.05,P〈0.01）。结论三七总皂苷对铝暴露下的脑微血管内皮细胞具有一定的保护作用,可增加血脑屏障紧密连接主要组成蛋白ZO-1的表达。     

胰腺干细胞体外诱导分化为胰岛素分泌细胞及对1型糖尿病模型鼠的治疗作用

背景：有实验证实人和动物起源的胚胎干细胞或成体干细胞可分化为胰岛素分泌细胞，但其分泌胰岛素的功能及对实验性糖尿病的治疗价值尚需要验证。 目的：观察从大鼠的胰腺组织分离纯化干细胞在体外将诱导分化胰岛素分泌细胞后胰岛素mRNA的表达、分泌胰岛素的能力及对1型糖尿病模型鼠的治疗作用。 设计：随机对照观察。 单位：中日友好医院临床医学研究所。 材料：实验于2004-08／2007—12在北京中日友好医院临床医学研究所病理生理研究室完成。选用8—10周龄雄性SD大鼠及雌性裸鼠各10只，均购自北京维通利华实验动物技术有限公司。实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准。尼克酰胺、链脲菌素均为Sigma公司产品，nestin抗体为BD Biosciences产品。大鼠胰岛素放射免疫检测试剂盒购自Linco research。胰岛素抗体及胰高糖素抗体为Santa Cruz产品。 方法：应用nestin结合的免疫磁珠从SD大鼠胰腺导管细胞中分离和纯化干细胞，经体外扩增及诱导分化形成胰岛素分泌细胞。①采用RT-PCR法检测细胞分化过程中胰岛素mRNA的表达。②将干细胞经诱导分化形成的胰岛进行冰冻切片，采用免疫荧光染色观察胰岛素及胰高糖素阳性细胞表达。③对干细胞分化胰岛的胰岛素释放功能进行评价，放射免疫法测定上清中胰岛素检测干细胞分化形成的胰岛分泌胰岛素的能力。④鼠按220mg／kg链脲菌素腹腔注射法制备为1型糖尿病模型，造模后随机摸球分为天然胰岛组及干细胞胰岛组，每组5只。将大鼠天然胰岛（SD大鼠分离）及干细胞分化形成的胰岛分别移植于糖尿病裸鼠左肾包膜下，观察移植后鼠尾静脉血糖变化。 主要观察指标：①细胞分化过程胰岛素mRNA表达。②胰岛样结构中胰岛素及胰高糖素阳性细胞表达。③干细胞分化形成的胰岛分泌胰岛素情况。④移植后鼠尾静脉血糖变化。 结果：①RT-PCR检测结果表明胰岛素mRNA的表达随诱导时间延长而明显升高。②免疫荧光染色结果显示胰岛结构的中间存在大量胰岛素阳性细胞，胰高糖素阳性细胞主要分布于胰岛样结构的周边。③干细胞分化的胰岛在高浓度葡萄糖刺激后明显缺乏快速相的胰岛素释放，而是表现细胞外上清中胰岛素浓度的缓慢升高。④天然胰岛组移植后3d使血糖降低到10mmol／L以下，至观察到60d仍维持在正常水平；干细胞胰岛在移植后8d使血糖降低至10mmol／L以下，且在移植35d后血糖逐渐升高并恢复到胰岛移植前的水平。 结论：大鼠胰腺干细胞经体外扩增和诱导分化后可分化胰岛素分泌细胞，但对葡萄糖的刺激没有快速相的胰岛素分泌。将胰岛素分泌细胞移植到1型糖尿病模型裸鼠后可一定程度地改善糖代谢的紊乱。     

糖基化终末产物诱导大鼠视网膜微血管内皮细胞表型和功能改变

目的 研究糖基化终末产物(AGEs)诱导大鼠视网膜微血管内皮细胞表型和功能的变化及相关机制.方法 SPF级雄性Wistar大鼠20只,7～8周龄,体重260～280 g,分离培养大鼠视网膜内皮细胞,采用免疫荧光染色、流式细胞术和体外形成毛细血管样网络结构的方法进行鉴定.视网膜内皮细胞在AGEs刺激后,用噻唑蓝(MTT)法分析细胞的增殖能力;用膜连蛋白V/碘化丙啶(Annexin V/PI)双染法检测细胞凋亡;采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和流式细胞术检测细胞AGEs受体、人蛋白激酶C(PKC)、细胞间黏附分子1(ICAM-1)和诱导型一氧化氮合酶(iNOS)的表达变化.采用t检验进行统计学分析.结果 分离纯化的大鼠视网膜内皮细胞表达血管性血友病因子(vWF)并在人工基膜上形成毛细血管网络结构.AGEs以时间和剂量依赖的方式抑制大鼠视网膜内皮细胞增殖能力,在200 mg/L的AGEs组培养至第5天时细胞增殖能力低于对照组(t=8.9,P＜0.05),7 d和9 d时抑制作用更明显(t值分别为15.7和46.1,均P＜0.01).400 mg/L AGEs组在第3天开始出现细胞增殖减慢(t=12.5,P＜0.05),从第5天开始增殖速度明显低于对照组(t值分别为22.4、41.5和77.7,均P＜0.01).并且AGEs诱导视网膜内皮细胞凋亡.进一步分析发现AGEs上调了大鼠视网膜内皮细胞AGEs受体、PKC、ICAM-1和iNOS的mRNA表达(t值分别为91.8、9.22、16和42,均P＜0.01)和蛋白水平的表达(t值分别为20.2、12.3、7.7和13.9,均P＜0.01).结论 AGEs可能通过上调AGEs受体诱导大鼠视网膜微血管内皮细胞表型和功能的改变.     

清开灵对缺氧体外血脑屏障紧密连接蛋白ZO-1表达的影响

目的 观察缺氧对体外血脑屏障(blood brain barrier,BBB)紧密连接蛋白ZO-1表达的影响以及清开灵的干预作用.方法 通过体外培养Balb/c小鼠脑微血管内皮细胞系形成BBB,采用缺氧缺糖24 h建立BBB缺血损伤模型,分别以荧光实时定量和Western blot的方法测定BBB紧密连接蛋白ZO-1的基因转录和蛋白表达水平,同时观察不同剂量清开灵对ZO-1表达的影响.结果 与正常组相比,缺氧缺糖24 h可使BBB表达ZO-1明显减少(P<0.01).清开灵能够显著增加缺血后ZO-1的基因转录和蛋白表达水平,与模型组差异显著(P<0.05或P<0.01).结论 清开灵可通过改善脑缺血对BBB主要组成蛋白的表达,发挥其对缺血性脑中风的脑保护作用.     

三七总皂苷对铝暴露体外血脑屏障通透性的影响

目的 探讨三七总皂苷对铝暴露下血脑屏障功能的影响,初步揭示三七总皂苷拮抗铝神经毒性,防治阿尔茨海默病的可能机制及靶点.方法 采用细胞插入器培养单层脑微血管内皮细胞Balb/c,建立体外血脑屏障模型.铝暴露24 h后,通过跨内皮细胞电阻(TEER)和辣根过氧化物酶(HRP)透过率的变化,观察三七总皂苷对铝暴露血脑屏障通透性的影响.结果 三七总皂苷能够提高TEER值,降低HRP透过率.其中,以高剂量组作用最为显著,与模型组比较差异有统计学意义(P＜0.05).结论 三七总皂苷可有效改善铝对血脑屏障功能性的损伤,这一作用可能是其抗阿尔茨海默病的脑保护作用机制之一.     

人胰岛分离和纯化技术要点以及移植后主要问题

胰岛移植是胰岛素依赖型糖尿病的一种有效的治疗方法,分离胰岛的数量和质量决定着胰岛移植的成败。虽然胰岛的分离和纯化是在Ricordi等所建立的胰岛分离方法的基础上发展起来的,并被认为是一种比较成熟的技术,但是目前真能很好掌握这项技术的胰岛移植中心为数不多,以至于埃德蒙顿胰岛移植方案并不能在大多数胰岛移植中心得到完美的重复。因此,进一步完善胰岛分离和纯化技术是每个胰岛中心需要不断探索的课题。     

人胚胎胰腺组织干细胞的分离鉴定和纯化

分离人胚胎胰腺组织中的胰岛细胞于体外培养,应用免疫细胞化学及RT-PCR的方法对其中的胰腺干细胞进行鉴定,并应用免疫磁珠的方法纯化其中的干细胞。结论是人胚胎胰腺组织中存在一定比例的干细胞,可以作为体外向胰岛素分泌细胞诱导分化的细胞来源。     

同一组织来源的肝癌干细胞分化能力异质性的体外研究

目的通过比较肝癌干细胞的不同单细胞克隆的体外分化能力,分析同一组织来源的肿瘤干细胞分化能力是否具有异质性,以进一步明确肿瘤干细胞的分化特性,为靶向肿瘤干细胞的治疗提供实验依据。方法通过有限稀释法对肝癌干细胞进行单细胞克隆培养,获得的单细胞克隆通过MTT测定比较其增殖能力。然后分别挑选增殖速度较快和较慢的3个克隆,采用RT-PCR方法比较其干细胞标志物表达水平。对干细胞标志表达水平高的3个克隆(A2、A3和B2)进行向成骨、软骨和脂肪方向的诱导分化。采用实时荧光定量PCR方法检测诱导前后成骨、软骨和脂肪标志分子的表达。结果获得的20个单细胞克隆增殖能力不同,并且增殖能力快的克隆表达干细胞标志物CD133、Oct4、c-kit、SCF、nestin比增殖能力慢的克隆强。向成骨方向诱导后,A2、A3和B2克隆I型胶原mRNA表达水平分别升高了(4.71±0.11)、(2.13±0.15)和(3.82±0.3)倍;骨钙素mRNA的表达水平分别升高(8.55±0.18)、(7.02±0.03)和(7.91±0.09)倍,说明A2克隆向成骨细胞分化能力最强。向软骨方向诱导后,B2分化能力最强,软骨标志分子蛋白聚糖和II型胶原的表达分别上调(25.01±0.19)倍和(17.49±0.19)倍,而在A2未发生明显变化,A3只轻微上调。向脂肪方向诱导后,A2、A3和B2克隆脂联素mRNA表达水平分别升高了(6.12±0.15)、(11.45±0.36)和(12.41±1.03)倍,过氧化物酶体增殖物激活受体γmRNA的表达水平分别升高(4.92±0.02)、(9.54±0.18)和(8.96±0.11)倍。结论来源于同一组织的肝癌干细胞在分化能力上具有异质性,这可能是导致肿瘤组织异质性的原因之一,也提示靶向肿瘤干细胞的治疗需要联合用药。