微血管内皮细胞的培养及其在医学研究中的应用

血 管内皮细胞是衬附于血管内壁的一层细胞 ,它不仅是构成血管组织间屏障的重要成分 ,而且在调节机体内环境的稳定、维持正常生理和免疫功能、以及介导疾病的发生、发展和转归等方面都发挥主要的作用。因此 ,血管内皮细胞的研究在医学研究中具有重要的价值。从 1973年JaffeEA等     

大鼠胰岛素瘤实验模型的建立及其应用

目的 通过移植大鼠胰岛素瘤INS-1细胞至糖尿病小鼠肾包膜下使之形成胰岛素瘤,并诱导其发生凋亡,建立可用于研究胰岛β细胞凋亡机制的动物模型.方法 将5×106 INS-1细胞接种于链脲霉素(STZ)造模的糖尿病小鼠左肾包膜下,监测动物空腹血糖和血清胰岛素水平的变化,当血糖趋近正常后摘取动物左侧肾脏并检测其血糖和血清胰岛素水平的变化;固定包埋摘取的肾脏,进行HE染色以及胰岛素的免疫组化染色,确定胰岛素瘤模型的建立.在胰岛素瘤动物模型中,腹腔给予毒胡萝卜素(TG)或软脂酸钠(PA),监测给药后动物空腹血糖的变化,当血糖浓度出现逆转时,摘取动物左侧肾脏,通过TUNEL原位染色法检测移植瘤细胞的凋亡.结果 将INS-1细胞移植到糖尿病小鼠肾包膜下后,从第9天开始,动物空腹血糖进行性降低,血清胰岛素水平逐渐升高,当动物血糖接近至正常时,摘取动物左肾导致动物血糖显著升高,在摘取的左肾可见明显的移植瘤,免疫组织化学染色显示移植瘤细胞为胰岛素阳性.在胰岛素瘤动物模型给予TG或PA刺激后,动物空腹血糖出现逆转,显著升高,血清中胰岛素含量明显降低,摘取动物左侧肾脏后,TUNEL原位染色发现移植瘤内有明显的细胞凋亡.结论 大鼠胰岛素瘤INS-1细胞肾包膜下移植可以建立胰岛素瘤动物模型,应用此动物模型可以在体内研究胰岛β细胞凋亡的机制.     

清开灵对小鼠脑微血管内皮细胞缺氧损伤MLCK基因转录的影响

目的:研究清开灵对小鼠脑微血管内皮细胞缺氧损伤MLCK基因转录的影响。方法:细胞分为正常对照组(有糖Earle液)、模型组(缺氧缺糖模拟缺血:无糖Earle液,37℃,5%CO2,1%O2培养24 h)、清开灵低、中、高浓度组(缺氧缺塘+清开灵1%、2%、4%),在37℃、5%CO2培养箱中培养24 h后经MTT比色法检测细胞活力、荧光定时定量PCR检测MLCK基因转录。结果:缺氧缺糖24 h后微血管内皮细胞活性降低(P<0.05)、MLCK基因转录被抑制(P<0.05);清开灵1%、2%、4%组均抑制了缺糖缺氧条件下微血管内皮细胞活性的降低(P<0.05),清开灵4%组降低MLCK的表达(P<0.05)。结论:缺糖缺氧条件下微血管内皮细胞活性降低。清开灵通过抑制MLCK的表达,恢复BBB的部分屏障功能。     

胰腺或胰岛移植防止或逆转糖尿病血管病变的研究进展

糖尿病已成为世界上发病率最高、对人类健康威胁最为严重的疾病之一.近年来,糖尿病的发病率不断上升,而且发病更趋年轻化.因此,糖尿病的防治成为目前医学研究的热点.糖尿病患者由于胰岛素产生障碍或胰岛素不能完全发挥生理作用而引起糖代谢紊乱,导致大血管及微血管病变,进而引发一系列并发症(包括动脉粥样硬化、肢体缺血坏死、视网膜病变和肾功能衰竭).虽然采用胰岛素治疗在一定程度上能够改善患者糖代谢紊乱,然而这种方法并不能有效地防止或逆转糖尿病引起的血管病变及其并发症.     

糖基化终末产物上调人胰岛微血管内皮细胞黏附分子的表达和白细胞黏附

目的 研究糖基化终末产物（AGEs）对人胰岛微血管内皮细胞（HIMVEC）黏附分子表达和白细胞黏附的影响.方法 HIMVEC细胞在200 mg/L的AGEs刺激后,用细胞基础的酶联免疫吸附法（ELISA）和Western blotting法检测细胞表面黏附分子的表达;并与BCECF标记的白细胞共培养检测与白细胞的黏附能力.采用实时荧光定量聚合酶链反应（RT-PCR）和Western blotting分别检测HIMVEC细胞上AGEs受体（RAGE）、蛋白激酶Cβ（PKC β）和蛋白激酶A（PKA）的mRNA表达情况.随后给予PKC β抑制剂LY333531或PKA激活剂8-Br-cAMP,观察对HIMVEC黏附分子表达的影响及和白细胞黏附的影响.两组间比较采用t检验进行分析.结果 与对照组相比,AGEs处理后HIMVEC表达P选择素、E选择素和血管细胞黏附分子1（VCAM-1）均上调（分别为1.10 ±0.13比0.64±0.14,0.83 ±0.06比0.47 ±0.05,0.87 ±0.09比0.43±0.07,t =4.93、9.40、7.61,均P＜0.05）,并且与白细胞的黏附较对照组明显增加（54 ±4比23 ±3,t=12.69,P＜0.05）.与AGEs组比较,RAGE抗体组P选择素、E选择素和VCAM-1的表达明显降低,组间差异具有统计学意义（t=5.69、6.89、5.43,均P＜0.05）.RAGE抗体组白细胞黏附明显少于AGEs组（54±4比31 ±4,t=8.22,P＜0.05）.与对照组相比,AGEs处理HIMVEC 4 h和18h,在mRNA水平和蛋白质水平均检测到RAGE和PKCβ的表达上调,但PKA的表达下调（t=10.94、7.76、21.82、5.85、10.96、11.47,均P＜0.05）.与AGEs组相比,在AGEs处理时给予PKCβ抑制剂LY333531或PKA激活剂8-Br-cAMP,均可降低HIMVEC上P选择素、E选择素和VCAM-1的表达水平（=7.60、6.60、6.25、11.58、4.08、3.47,均P＜0.05）,并减少白细胞的黏附（t=7.67、8.89,均P＜0.05）.结论 AGEs通过RAGE受体上调PKCβ和下调PKA增加HIMVEC上黏附分子的表达,促进白细胞的黏附,可能是糖尿病状态下胰岛中白细胞浸润的机制之一.     

三七总皂苷对铝暴露体外血脑屏障通透性的影响

目的探讨三七总皂苷对铝暴露下血脑屏障功能的影响,初步揭示三七总皂苷拮抗铝神经毒性,防治阿尔茨海默病的可能机制及靶点。方法采用细胞插入器培养单层脑微血管内皮细胞Balb/c,建立体外血脑屏障模型。铝暴露24h后,通过跨内皮细胞电阻（TEER）和辣根过氧化物酶（HRP）透过率的变化,观察三七总皂苷对铝暴露血脑屏障通透性的影响。结果三七总皂苷能够提高TEER值,降低HRP透过率。其中,以高剂量组作用最为显著,与模型组比较差异有统计学意义（P〈0.05）。结论三七总皂苷可有效改善铝对血脑屏障功能性的损伤,这一作用可能是其抗阿尔茨海默病的脑保护作用机制之一。     

永生化人肝窦内皮细胞株的形态和功能特性研究

目的 研究永生化人肝窦内皮细胞(LSEC)株的形态和功能特性,评价其作为体外研 究肝缺血再灌注损伤的细胞材料的可行性.方法 首先应用细胞免疫荧光染色、荧光显微镜以及流 式细胞术检测LSEC细胞株的纯度,透射和扫描电子显微镜技术观察细胞内的W-P小体和吞噬磁珠 的能力以及细胞表面窗孔结构.然后利用MTT法检测细胞的生长曲线,ELISA 法比较TNF-α刺激后人LSEC细胞株和原代LSEC黏附分子、纤溶活性分子和细胞因子的表达.最后采用TUNEL法比较两者对冷缺血再灌注损伤诱导凋亡的敏感性.结果 所建立的人LSEC 细胞株纯度达到95%以上.在形态上,人LSEC细胞株胞质内含有W-P小体,表面具有LSEC特异的窗孔结构.在功能上,人LSEC细胞株具有吞噬磁珠的能力和较强的增殖能力.在TNF-α刺激下,人LSEC细胞株和人原代 LSEC均剂量依赖性表达ELAM-1和ICAM-1,释放PAI-1、t-PA和u-PA;但人LSEC细胞株不产生IL-6 和IL-8.经冷缺血再灌注后,人LSEC细胞株的凋亡细胞百分率达到(38.4±6.7)%,明显高于人原代LBEC的(28.6±4.5)%和人脐静脉内皮细胞的(7.8±1.2)%.结论 已建立的人LSEC细胞株具有人原代LSEC的形态和主要功能特性,保留了对冷缺血再灌注损伤诱导凋亡的高度敏感性,因此可以作为体外研究肝脏缺血再灌注损伤机制的细胞材料.     

体外培养人胰岛素瘤细胞的特性

目的分离培养人胰岛素瘤细胞,并研究它的功能特性。方法原代分离人胰岛素瘤细胞,经多次筛选培养进行纯化。通过荧光显微镜观察细胞特有的自发荧光;RT-PCR方法检测胰岛素mRNA的表达和胰岛细胞自身抗原IA-2、IAR和ICAp69的表达;应用MTT方法检测抗人IA-2抗体对胰岛素瘤细胞的杀伤。结果分离的人胰岛素瘤细胞经传40代,在悬浮培养条件下可自发聚集成胰岛样结构,并有自发荧光。该细胞表达胰岛素mRNA并合成胰岛素,但明显低于大鼠胰岛素瘤细胞INS-1。该细胞也表达人胰岛细胞自身抗原IA-2、IAR和ICAp69,并且用抗人IA-2抗体与之孵育后可出现抗体剂量依赖性的细胞杀伤。结论此分离培养的人胰岛素瘤细胞表达人胰岛素和人胰岛细胞自身抗原,因此可以作为研究人Ⅰ型糖尿病发病机制的细胞模型。     

血管内皮生长因子在神经胶质瘤中的表达特点和恶性进展的关系

目的：通过观察神经胶质瘤中血管内皮生长因子（VEGF）的表达状况,探讨VEGF在神经胶质瘤中的表达特点及其与肿瘤恶性进展的关系.方法：采用免疫组化二步法对恶性度不同的神经胶质瘤石蜡标本中VEGF进行检测.结果：在57例胶质瘤中32例观查到了VEGF蛋白表达.VEGF阳性表达在星形细胞瘤、间变性星形细胞瘤和多形性胶质母细胞瘤中分别为36.8%、57%和73%.结论：VEGF是一种能反映胶质瘤恶性度的客观指标,并且也是一种比形态学更为敏感的能反映胶质瘤恶性进展的生物学指标.VEGF表达高低,可间接作为胶质瘤向周围脑组织侵袭和扩散的参考指标.     

清开灵对缺氧体外血脑屏障紧密连接蛋白ZO-1表达的影响

目的观察缺氧对体外血脑屏障（blood brain barrier,BBB）紧密连接蛋白ZO-1表达的影响以及清开灵的干预作用。方法通过体外培养Balb/c小鼠脑微血管内皮细胞系形成BBB,采用缺氧缺糖24 h建立BBB缺血损伤模型,分别以荧光实时定量和Western blot的方法测定BBB紧密连接蛋白ZO-1的基因转录和蛋白表达水平,同时观察不同剂量清开灵对ZO-1表达的影响。结果与正常组相比,缺氧缺糖24 h可使BBB表达ZO-1明显减少（P〈0.01）。清开灵能够显著增加缺血后ZO-1的基因转录和蛋白表达水平,与模型组差异显著（P〈0.05或P〈0.01）。结论清开灵可通过改善脑缺血对BBB主要组成蛋白的表达,发挥其对缺血性脑中风的脑保护作用。