人PD-1-Fc融合分子的构建及其在CHO细胞中的表达与鉴定

目的利用基因工程手段构建hPD1Fc重组cDNA,用真核表达系统制备有活性的hPD1Fc融合蛋白。方法PCR方法扩增编码hPD1膜外区的cDNA序列,将其与人IgG1Fc和pcDNA3.1( )片段连接,构建成hPD1Fc重组表达载体。用脂质体法转染CHO细胞,夹心ELISA法检测上清液中融合蛋白hPD1Fc的表达,经ProteinA亲合层析纯化,SDSPAGE、免疫印迹鉴定表达产物。结果PCR扩增得到编码人PD1全长的288aa编码基因片段,将其膜外区167aa的编码序列与hIgG1Fc的cDNA片段一起连接并插入pcDNA3.1( )表达质粒。重组质粒转染CHO细胞后,夹心ELISA法检测显示培养上清液中有hPD1Fc蛋白表达。纯化后的hPD1Fc蛋白经SDSPAGE和免疫印迹鉴定其相对分子质量约42800,与理论预测值相符。结论成功构建了hPD1Fc重组表达载体,利用哺乳动物细胞CHO表达出有活性的hPD1Fc融合蛋白,为进一步研究PD1分子在免疫耐受、自身免疫性疾病中的作用奠定了基础。     

免疫磁珠法分离人外周血CD4+CD25+调节性T细胞

目的 建立人外周血单个核细胞中CD4 CD25 调节性T细胞(regulatery T cells,Treg)免疫磁性细胞分离力(megnetic activated cell sorting,MACS),并鉴定其分离效率.方法 采用免疫磁珠两步法(即阴性分选和阳性分选2步)分离人周血单个核细胞中的CD4 CD25 调节性T细胞,首先采用生物素标记的鸡尾酒抗体和抗生物素标记的磁珠阴性分选CIM细胞,再用抗CD25 的磁珠阳性分选CD4 CD25 T细胞.分离后的细胞经抗体染色后再通过流式细胞仪检测其分离纯度;内因子染色检测其转录因子FOXV3的表达频率;台盼蓝染色检测细胞的存活率;3H-TdR掺入法检测其对CD4 CD25-T细脆殖抑制效应.结果 阴性分选CD4 T细胞的纯度为(92.2±1.7)%,阳性分选后CD4 CD25 Treg细胞的纯度(95.1±1.2)%.胞内因子染色FOXF3在CD4 CD25 Treg细胞中的表达率为(80.4±1.2)%,台盼蓝染色细胞存活率为(95.6±3.3)%.3H-TdR掺入法检测其对CIM CD25-T细胞具有明显的抑制作用.结论 采用免疫磁性细胞分离技术能够高效、快地得到一群纯度高并且细胞活力好的CD4 CIY25 Treg,为进一步研究其功能提供了方便.     

FLK1265-2493与C3d3融合基因真核表达质粒的构建及表达

目的 构建FLK1265-2493与C3d3融合基因真核表达质粒,并在体外进行表达和鉴定。方法采用PCR技术扩增FLK1265—2493片段,将该片段插入到pMDT-18载体中后,亚克隆至真核表达载体pSG．SS．C3d3．YL,构建FLD1265-2493与C3d3融合基因表达质粒。经限制性酶切鉴定和DNA序列测定结果证实后,将重组质粒pSG．SS．FLK1265—2493．C3d3．YL转染Hela细胞,检测其体外表达。结果免疫印迹和免疫细胞化学分析结果分别表明转染细胞上清液和胞浆内均有目的分子的存在。结论构建的DNA疫苗可在真核细胞内正确表达,这为进一步的动物实验打下了基础。     

CT抗原KM-HN-1 HLA-A * 0201限制性表位预测及其与HLA-A * 0201结合强度分析

目的通过对CT抗原（cancer-testis antigen）KM-HN-1进行HLA-A＊0201限制性表位预测,并对候选表位肽与HLA-A＊0201分子结合亲和力及复合物稳定性进行分析,为探索基于KM-HN-1的免疫治疗奠定基础。方法利用基于蛋白酶体剪切位点特异性的算法PAProc及基于肽MHC-I结合的算法BIMAS和SYFPEITHI对KM-HN-1进行HLA-A＊0201限制性表位预测．合成KM-HN-1相关候选表位肽KM-HN-I321-329（KLLPFRETV）,KM-HN-I303-211,（FLPTAPPNV）,KM-HN-I629-637。（TLLQIIETV）,KM-HN-I87-95（ILNKSIIEV）,KM-HN-I538-596。（QMMEALDQL）及阳性对照肽HBVcAg18-27（FLPSDFFPSV）;对这些合成肽与HIA-A＊0201分子结合亲和力及其复合物稳定性根据文献报道的方法进行分析。结果KM-HN-I321-329（KLLPERETV）结合亲和力最低,KM-HN—I203-211（FLPTAPPNV）结合亲和力最高,其余3条肽结合亲和力介于2者之间;稳定性实验（DC50）结果显示：KM-HN-I538—546（QMMEALDQL）DC50小于2h,KM—HN-I321-329（KLLPERETV）的DC50介于2～4h之间,KM-HN-I87-95。（ILNKSIIEV）的DC50介于6～8h之间,KM-HN-I233-211（HLPTAPPNV）及KM-HN-I629—633（TLLQIIETV）的DC50均大于8h。结论基于蛋白酶体剪切位点特异性的算法及基于肽MHC-I结合的算法对KM-HN-1进行HLA-A＊0201限制性表位预测,结合候选表位肽与HLA-A＊0201分子结合的亲和力与复合物稳定性实验分析,为该抗原HLA-A＊0201限制性表位的鉴定奠定了基础。     

重组跨膜型人CD55分子在小鼠NIH3T3细胞上的表达及其补体溶破保护功能的研究

目的 :在小鼠NIH3T3细胞转染表达人天然GPI锚固型CD5 5和重组跨膜型CD5 5 TM分子 ,观察比较它们对人补体溶破异源细胞的抑制功能。方法 :将带有CD5 5cDNA、CD5 5 TMcDNA的重组逆病毒表达质粒CD5 5 pLXSN、CD5 5TM pLXSN经脂质体法转染PA317细胞 ,用病毒上清感染小鼠成纤维母细胞NIH3T3。经G418加压筛选 ,利用FACS检测获得表达CD5 5和CD5 5 TM分子的阳性细胞克隆 ,通过MTT比色法比较两种分子对人血清补体溶破细胞的抑制功能有无差别。结果 :细胞转染筛选获得多个表达跨膜型人CD5 5分子的NIH3T3细胞克隆 ,补体杀伤试验证实其具有抑制人补体溶破的功能 ,且两种分子的补体抑制功能无明显差异。结论 :成功地建立了稳定表达天然CD5 5、跨膜型CD5 5分子的小鼠NIH3T3细胞 ,证实其表达的GPI型CD5 5分子和CD5 5TM分子均具有抑制人补体溶破细胞的功能 ,为进一步探讨应用跨膜型的CD5 5分子对PNH进行基因治疗奠定了基础。     

磁转联合脂质体实现高效细胞转染

目的优化体外培养细胞的外源基因转染方案。方法采用磁性微粒联合脂质体，将重组人绿色荧光蛋白表达载体（pAAV-IRES-GFP）外源DNA定向转染COS-7细胞，荧光显微镜下观察外源基因的表达，比较不同转染条件及DNA载量的细胞转染效果。结果DNA与Combimag按1：1的比例混合转染可以得到很高的转染效率，过高的DNA载量使转染效率减低。结论利用磁转结合脂质体可使低剂量的DNA达到快速、简便和高水平的转染。     

人补体膜辅助调节蛋白MCP的基因克隆及共真核表达的研究

目的 克隆获得编码人补体膜辅助调节蛋白（ＭＣＰ）的ｃＤＮＡ，并对其在真核细胞的表达及功能进行研究。方法 应用ＲＴ－ＰＣＲ 方法，从Ｕ９３７细胞总ＲＮＡ中扩增编码人ＭＣＰ分子的ｃＤＮＡ片段，快速克隆于ｐＧＥＭ－Ｔ Ｅａｓｙ载体，测定共序列。将该片段重组于ｐＬＸＳＮ载体，电穿孔转染ＮＩＨ３Ｔ３细胞，经ＦＡＣＳ检测筛选表达ＭＣＰ的阳性细胞克隆，用补体容破试验鉴定其抑制人补体溶破的功能。结果 ＲＴ－ＰＣＲ     

MicroRNAs途径在RAW264.7细胞中作用的初步研究

目的通过检测microRNAs生成的关键酶Dicer在RAW264.7细胞不同功能状态下的表达差异研究microRNAs途径在其中产生的作用。方法采用QRT-PCR、流式细胞术等对RAW264.7细胞在不同功能分化状态下的Dicer酶进行检测。结果GMCSF与MCSF分别刺激RAW264.7细胞诱导其增殖分化后,Dicer酶的mRNA水平显著增高,但随刺激时间呈现不同趋势(P<0.01);在诱导凋亡死亡状态下,RAW264.7中Dicer酶的表达下降30%(P<0.01);LPS与IL-4分别诱导RAW264.7细胞分化为M1和M2型,Dicer的表达与M1、M2型相关炎性因子的表达有相关性。结论 MicroRNAs调控途径参与并影响RAW264.7不同功能状态。     

55例急性缺血性脑卒中的治疗分析

目的探讨急性缺血性脑卒中的有效治疗方法。方法对55例急性缺血性脑卒中患者根据病情使用降血压、降血糖药和脱水剂、维持水电平衡;除应用舒血宁注射液、胞二磷胆碱注射液、抗血小板聚集药物外,加用依达拉奉注射液30mg加0．9％氯化钠注射液100ml中静脉滴注,2次／d,共14d。结果本组55例经治疗后,基本痊愈18例,显著进步25例,进步8例,无变化4例,总有效率92．7％。治疗期间,有3例出现谷丙转氨酶轻度升高,2例出现皮疹,未减药、停药而自行恢复。结论加用依达拉奉的综合疗法具有安全、有效、副作用小等特点,是治疗缺血性脑卒中的有效方法。