2型猪链球菌荚膜唾液酸合成相关基因neuC敲除突变株的构建及其生物学特性

目的探索荚膜多糖合成基因neuC与细菌唾液酸合成转化的关系。方法应用同源重组基因敲除方法构建筛选2型猪链球菌(SS2)强毒株05ZYH33荚膜多糖组分唾液酸合成相关基因neuC的缺失突变株;系统比较分析突变体与野生株的基本生物学特性的差异,小鼠和仔猪毒力试验分析neuC基因缺失对细菌毒力的影响。结果应用PCR检测和Southern杂交分析显示,neuC基因在2株转化重组体中被壮观霉素抗性基因所替代,表明neuC基因敲除突变体构建成功;突变体△neuC与野生株在菌落形态、染色特性和溶血活性方面无明显差异;突变体与2型特异性抗血清的凝集反应显著减弱;电镜观察显示突变体表面荚膜结构较野生株荚膜显著变薄,直径20～55nm,但质地更致密;小鼠和仔猪毒力试验显示,突变体毒力显著减弱。结论neuC是SS2荚膜多糖合成的重要结构基因,与细菌唾液酸的转化利用密切相关;neuC基因可能藉其在唾液酸转化中的作用影响SS2的基本生物学特性和细菌的侵袭致病能力。     

CiaRH生物信息学分析及其在不同猪链球菌血清型中的分布

目的 对猪链球菌2型中二元信号转导系统CiaRH的序列进行分析并评估该系统在不同血清型中的分布。方法 利用生物信息学方法分析其组分蛋白的结构域。PCR及序列分析手段评估CiaRH在不同血清型猪链球菌中的分布情况。结果 比对结果显示,CiaRH同源蛋白存在于链球菌属的不同种细菌中。结构分析发现,在CiaH的N-端包含两个跨膜区,其间的间隔区域发现一个可能用来结合环境信号的PDC结构域;CiaH的C-端为保守的HisKA及HATPase_C结构域。PCR及序列比对结果显示,CiaRH在不同血清型猪链球菌中广泛分布。结论 提示CiaH为胞外感应型组氨酸激酶。在CiaR的N-端为保守的信号接收结构域REC,而C-端为具有DNA结合功能的trans_reg_C结构域。     

猪链球菌2型中国强毒株CovR重组蛋白及其抗体的制备

目的通过构建pET32a-covR原核表达质粒,表达并提纯CovR重组蛋白,制备其多克隆抗体。方法采用PCR法,从四川资阳病人分离株05ZYH33基因组扩增CovR的编码基因covR,构建重组表达质粒pET32a-covR,转化E.coliBL21(DE3),筛选阳性转化子进行IPTG诱导表达,产物经SDS-PAGE鉴定后,His亲和层析柱纯化CovR重组蛋白;免疫新西兰兔制备特异性抗体,Western blot检测兔多抗血清的特异性,间接ELISA检测其滴度。结果covR基因在原核细胞中得到高效表达,重组蛋白免疫新西兰兔后血清效价高达1∶204800,且重组蛋白能够与之发生特异性的反应。结论成功构建了表达载体pET32a-covR,可在E.coliBL21中高效表达,制备了特异性抗体,为进一步研究CovR的调控机理奠定了基础。     

猪链球菌2型二元信号转导系统ciaR基因敲除突变株的构建及生物学功能研究

目的构建猪链球菌2型强毒株05ZYH33二元信号转导系统1094HK/1095RR的反应调节因子ciaR基因敲除突变株(ΔciaR),并研究ΔciaR的生物学功能。方法和结果基于同源重组原理筛选ciaR基因缺失株,PCR分析及Southern杂交结果均显示突变株构建成功。通过检测OD600值绘制生长曲线,发现突变株在37℃和40℃其OD600值均明显低于野生株;与40mmol/L过氧化氢共作用15min后涂板计数,突变株存活率明显低于野生株;不同pH值的培养基中培养,发现在pH5.0的酸性环境中突变株OD600值明显低于野生株;野生株与突变株对BALB/c小鼠攻毒(约1×109CFU/只),各10只,两组16h后均死亡9只。结论成功获得05ZYH33ciaR基因敲除突变株;发现删除ciaR基因会导致细菌的生长繁殖能力减弱,抗氧化应激能力下降,在酸性环境生长存活能力下降;但对小鼠毒力无差别。     

细菌基因盒-整合子系统与细菌耐药性

细菌耐药性逐年上升和耐药性快速传播近年来已成为临床治疗感染性疾病的难题,细菌最常见的对抗和逃避抗菌药物的方式,是从外源获得耐药基因,而耐药基因的传播可以是从一个细菌到另一个细菌,也可以从一个DNA分子到另一个DNA分子。整合子一基因盒系统于1991年由Hall正式提出,是细菌的天然克隆与表达系统。能捕获外来耐药基因,在整合子中可形成多种耐药基因的组合、排列。整合于整合子上的基因盒可借助整合子的强启动子而得以表达．是近年来发现的细菌耐药性传播的机制之一。     

基因芯片技术检测恙虫病东方体DNA的方法建立

目的　研制用于东方体检测的基因芯片 ,建立快速、灵敏、特异的恙虫病诊断方法。方法　根据东方体 5 6kD外膜蛋白基因序列 ,设计群特异性引物及探针 ,制备寡核苷酸芯片。用Cy3标记的引物 ,利用不对称PCR技术扩增DNA片段 ,将扩增的DNA片段与芯片上的探针杂交 ,用荧光扫描仪检测并分析信号。结果　建立的基因芯片能够检测恙虫病东方体标准株DNA的特异性荧光信号。具有特异、灵敏、快速的优点。结论　成功制备的基因芯片有望应用于恙虫病东方体多种样本的检测 ,为恙虫病提供最为理想的诊断方法。     

恙螨体内汉坦病毒核酸的基因芯片检测

目的 建立快速、灵敏、特异的汉坦病毒基因芯片诊断方法。方法 根据发表的汉坦病毒属(HV)76-118株和R22株S基因核苷酸序列，设计引物和探针，制备寡核苷酸芯片。用CV3标记核苷和引物，运用不对称PCR技术制备单链荧光标记核苷酸片段，并与芯片上的寡核苷酸探针杂交，荧光扫描仪检测并分析信号。结果 研究制备的基因芯片能够检测汉坦病毒HTN型和SEO型病毒核酸的特异性荧光信号。结论 HV的基因芯片检测具有特异、灵敏、快速的优点。基因芯片的制备和检测技术的建立，可为肾综合征出血热等传染病的诊断和预防提供理想的方法。     

人源化抗CD3单链抗体的构建、序列分析和表达研究

目的构建和表达抗CD₃单链抗体,并对其构象进行模拟分析.方法应用重叠延伸拼接法连接抗CD₃抗体的轻链可变区基因和重链可变区基因,构建抗CD₃单链抗体基因(ScFv),并将其克隆于原核表达载体中表达.结果拼接后的抗CD₃ScFv基因全长732bp,构象模拟分析表明其三维结构稳定,兼容性分数S>0,表达的目的蛋白约26.5kD.结论抗CD₃ScFv基因的成功构建,为进一步研究抗CD₃/抗乙肝病毒的双特异性抗体奠定了基础.     

爆发流行中毒性休克综合征病原体生物学特性及鉴定

目的 探讨江苏省南通、如皋、海安、泰兴等地爆发流行猪传染病的病因，控制疾病流行及采取预防对策。方法 我们对分离株进行全面研究，并比较了不同地点、不同来源的3个分离株的生化特性、全菌体蛋白聚丙烯酰胺凝脉电泳图谱和DNA指纹图谱。结果 分离株均为革兰氏阳性菌，3个分离株具有相同的蛋白组成和DNA指纹图谱，属同一克隆株，但分离株与标准参照株不相同。结论 经综合分析鉴定，病原体为猪链球菌Ⅱ型，病猪是该起疾病爆发流行的传染源。     

^60Coγ射线照射对ABO血型单克隆抗体试剂稳定性的影响

~（６０）Ｃｏγ射线照射对ＡＢＯ血型单克隆抗体试剂稳定性的影响潘秀珍，唐家琪，季先富（南京军区军事医学研究所，南京２１０００２）关键词ＡＢＯ血型，单克隆抗体，~（６０）ＣＯ，γ射线在制备ＡＢＯ血型单克隆抗体（ＭｃＡｂ）试剂的实践中发现，个别批次试剂的效...