尼美舒利对人小细胞肺癌细胞株NCL-H446增殖的抑制作用

目的研究尼美舒利对人小细胞肺癌细胞株NCL-H446增殖的抑制作用,为临床治疗提供实验室依据。方法常规培养人小细胞肺癌细胞株NCL-H446,MTT法检测尼美舒利的细胞毒性作用;倒置显微镜与Hoechst33258荧光染色观察细胞形态学变化;流式细胞术(FCM)分析细胞凋亡率。结果MTT显示尼美舒利呈剂量与时间依赖性抑制人小细胞肺癌细胞株NCL-H446的增殖;倒置显微镜下可见细胞变小、变圆、皱缩、部分细胞脱落飘浮于培养基中。荧光显微镜下可见细胞核染色质致密浓缩、荧光强度增强、染色质边集、核破碎,凋亡小体形成等。FCM检测结果表明尼美舒利既可诱导NCL-H446细胞凋亡,又可引起坏死,400μmol/L的尼美舒利作用细胞24h后,细胞早期凋亡率为7.65%,晚期凋亡率为29.76%,细胞坏死占23.9%。结论尼美舒利对体外培养的人小细胞肺癌细胞株NCL-H446有较显著的抑制作用,该作用与诱导细胞凋亡与坏死有关。     

可溶性mPDL1-hIgGFc表达载体构建、表达及对诱导细胞增殖与凋亡的影响

目的 可溶性mPDL1-hIgGFc(mouse PDL1-human IgG Fc)表达载体的构建与表达,及其对诱导细胞增殖与凋亡的研究.方法 以含有mPDL1基因的载体pmPDL1为模板,采用PCR的方法获得mPDL1胞外段基因,定向连接于含有hlgGFc基因片段的载体phIgGFc,构建表达载体pmPDL1-hIgGFc;采用脂质体将重组子转染CHO细胞,转染后的CHO命名为cHOp;ELISA和Western blot法检测目的 蛋白的表达,流式细胞术检测CHOp培养上清对混合淋巴细胞培养(MLC)的影响.结果 测序结果和酶切鉴定显示构建的表达载体pmPDL1-higGFc完全正确;ELISA和Westernblot法检测CHOp培养上清中有目的 蛋白表达;流式细胞术检测表明CHOp培养上清可体外抑制小鼠MLG,并诱导活化T细胞凋亡,其效应呈剂量依赖性.结论 成功构建mPDL1-hIgGFc表达载体;mPDL1-hIgGFc在体外可抑制MLC和诱导活化T细胞凋亡,具有负性调节T细胞的功能.     

湖北省汉族人群甘露糖结合凝集素基因启动子区多态性与SLE关联性的研究

甘露糖结合凝集素 (mannose bindinglectin ,MBL)是一种由肝脏合成和分泌的急性期蛋白 ,可激活补体 ,溶解病原菌〔1〕,并具有调理吞噬作用。是参与非特异性免疫防御的重要分子。MBL基因启动子区具有两个多态性位点 :H L( 5 5 0bp ,G C)和X Y( 2 2 1bp ,C G) ,可影响MBL基因的转录 ,降低血清中MBL的浓度。已证明启动子的单元型HY、LY、LX分别与血清中高、中、低水平的MBL相关〔2〕。系统性红斑狼疮 (SLE)的发病与抗原 抗体复合物的清除缺陷有关。由于MBL基因启动子区的多态性可影响MBL的基因转录及其在血清中的浓度 ,从而影…     

CTL对同种异体靶细胞杀伤作用的实验研究

目的：研究特异性CTL杀伤的效应与HLA型别之间的关系。方法：用已知型别的EB病毒转化的B淋巴母样细胞（Epstein-Barr-transformed B lymphoblastoid cell line,EBV-LCL）与同种异体外周血单个核细胞（PBMC）共培养，激活同种异体抗原特异性细胞毒性T细胞（cytotoxicity T cell,CTL），然后利用同位素释放法观察CTL对HLA－I类表型不同的EBV－LCL的杀伤活性。结果：用EBV－LCL－1刺激自身PBMC－1所诱翌的CTL－1a，只能杀伤EBV－LCL－1，而不能杀伤HLA－I类表型不同的EBV－LCL－2；但用EBV－LCL－2刺激PBMC－1所诱导的CTL－1b，却能有效杀伤HLA－I类表型不同的EBV－LCL－2。结论：①MHC表型不同的免疫细胞之间可以发生相互作用；②TCR既不单独识别靶细胞表面的抗原肽，也不直接识别靶细胞表面的MHC分子（MHC特异性抗 原决定簇），而是识别MHC－抗原肽复合物的表达综合信息，后者可能是由MHC－抗原肽复合物表面的空间构象、电荷性质及其分布等信息所构成；③所谓CTL的特异性杀伤作用，是MHC－抗原肽复合物表面信息激活该信息性T细胞克隆的结果。     

原核表达、稀释复性的可溶性HLA-G1抑制混合淋巴细胞培养中T细胞增殖

目的：探讨原核表达体外稀释复性的可溶性人类白细胞抗原G1（soluble　HLA-G1，sHLA-G1）对体外混合淋巴细胞反应中T细胞增殖的影响。方法利用原核表达的sHIA-G1的重链、轻链及人工合成的九肽，折叠形成正确构象的sHLA-G1．肽复合物；在混合淋巴细胞培养（MLC）体系中加入折叠所得的sHLA-G1-肽复合物及相同浓度的对照物，流式细胞仪检测T细胞的增殖情况。结果sHLA-G1．肽复合物加入到混合淋巴细胞培养中能够抑制T细胞的增殖，3个个体的抑制率分别为28．5％、32．5％及22．1％（Dunnett t检验，P〈0．05）；这种抑制作用可以被HLA-G特异性McAb（G11E5）所逆转。结论通过原核表达，体外稀释复性的方法可以大量制备正确构象的sHLA-G1-肽复合物，该复合物分子能够抑制混合淋巴细胞培养中T细胞的增殖。     

HLA-G1抑制人自然杀伤细胞杀伤猪血管内皮细胞的研究

目的　研究HLA G1基因抑制人自然杀伤细胞 (NK细胞 )对猪血管内皮细胞杀伤的作用。方法　利用脂质体介导的基因转染技术将 pcDNA3 HLA G1转入原代培养的猪血管内皮细胞 ,以间接免疫荧光技术在蛋白质水平上检测HLA G1分子在猪内皮细胞上的表达 ;以NK细胞系(NK92 )和外周血单个核细胞为效应细胞 ,用四甲基偶氮唑盐 (MTT)法检测转染细胞对NK细胞杀伤活性的抑制效应。结果　与未转染HLA G1的对照组相比 ,NK92和外周血单个核细胞对转有HLA G1的猪血管内皮细胞的杀伤效率均有明显降低 (P <0 .0 5 )。结论　HLA G1分子可以明显抑制人NK细胞对猪血管内皮细胞的杀伤。     

加载HPV6E7抗原肽的HLA-A2单体及其四聚体的制备和鉴定

目的制备可生物素化的可溶性HLA-A2/HPV6E7单体,进一步组装成PE标记的可溶性HLA-A2/HPV6E7四聚体。方法以原核表达的sHLA-A2BSP为重链,β2m为轻链,与人工合成的HPV6E7(22-30)抗原肽(GLH-CYEQLV)利用稀释法进行共折叠复性得到单体。利用HLAI类分子单抗(W6/3)和抗Bzm抗体进行Westernblot和ELISA鉴定折叠产物的构象。以BirA酶对其进行生物素化,经过超滤离心后得到纯化的sHLA-A2/HPV6E7单体,再与Streptavidin-PE按4:1比例混合形成四聚体。结果该四聚体具有与HLA-A2阳性HPV6感染的CA患者的抗原特异性CTL结合活性。结论成功获得了天然构象的sHLA-A2/HPV6E7单体及PE标记的HLA-A2/HPV6E7四聚体。     

胎膜早破对脐血瘦素的影响及其临床意义

目的　研究胎膜早破时脐血瘦素浓度变化及其临床意义。方法　采用放射免疫法 (RIA)检测 79例新生儿脐血样本的瘦素水平 ,其中有胎膜早破史的研究组 38例 ,无胎膜早破史的对照组 4 1例。并且追踪新生儿出生1周内感染发生的情况。结果　胎膜早破的脐血瘦素水平升高 (15 2 5± 6 0 4ng/ml) ,与对照组 (8 83± 3 180ng/ml)比较有显著性差异 (P <0 0 1) ;胎膜早破的脐血瘦素水平在不同的胎膜早破持续时间段比较 ,12hour≤胎膜早破 <72h (16 16 3± 3 5 86ng/ml)、胎膜早破≥ 72h (2 0 32 8± 6 76 8ng/ml)的脐血瘦素水平较胎膜早破 <12hour (10 4 13±2 994ng/ml)的脐血瘦素水平明显增加 ,其差异具有非常显著性的意义 (分别为P <0 0 1,P <0 0 1) ;而且胎膜早破的新生儿出生 1周内的感染发生率增高 (χ2 =6 6 5 2 ,P <0 0 1) ,临床发生感染的新生儿脐血瘦素水平增高 (17 35±5 4 9ng/mlvs 10 85± 5 18ng/ml,P <0 0 1)。结论　有胎膜早破史的新生儿脐血瘦素水平升高 ,特别在胎膜早破≥ 12小时后。脐血瘦素水平可作为反映机体免疫状况的指标 ,可提示机体有无宫内感染。     

病毒肽/HLA-A2复合物与抗转铁蛋白受体单链抗体融合蛋白的构建、表达及鉴定

目的 制备抗转铁蛋白受体单链抗体与病毒肽/HLA-A2的融合蛋白.方法 利用重组DNA技术将HLA-A2基因和转铁蛋白受体单链抗体(TfRscFv)基因,用柔性的linker(Gly-4-Ser)3连接并克隆到原核表达载体pET28a(+)上,转化大肠埃希菌BL21(λDE3)菌株,获取重组子,经IPTG诱导表达目的 蛋白.将纯化的目的 蛋白和β 2微球蛋白(β 2m)与HLA-A2限制性的乙肝病毒(HBV)核心抗原肽HBcAg 18-27在体外进行稀释复性,形成HBcAg 18-27/HLA-A2/TfRscFv融合蛋白.利用ELISA和微球结合试验检测融合蛋白的空间构象.结果 构建的融合蛋白基因具有正确的序列,经IPTG诱导后以包涵体形式表达的蛋白分子量正确,体外稀释复性后的融合蛋白具有正确的HLA-A2空间构象.结论 成功构建了HBcAg 18-27/HLA-A2/TfRscFv融合蛋白,为进一步将该融合蛋白通过其单链抗体加载到肿瘤细胞表面从而诱导乙肝病毒肽特异性细胞毒性T淋巴细胞杀伤肿瘤细胞奠定了物质基础.     

HLA-DR1二聚体的构建及其在昆虫细胞中的表达和纯化

目的 构建 HLA-DR1(由DRA和 DRB1*01 基因编码)杆状病毒表达载体,并使其在昆虫细胞内得到表达.方法 采用RT-PCR方法从721.221细胞中扩增DRα和DRβ的信号肽及胞外序列,运用重叠PCR将DRα和DRβ片段分别与Fos和Jun的亮氨酸拉链序列相连,成为DRα-Fos和DRβ-Jun,DRα和DRβ可凭借Fos和Jun的亮氨酸拉链结合形成DR1分子,再通过EcoR Ⅰ酶切位点将DRα-Fos和人IgG1的Fc段相连,形成DRα-Fos-Fc重组序列,2个同源的DR1分子可通过IgG1的Fc段的二硫键结合形成二聚体.分别将DRα-Fos-Fc及DRβ-Jun插入杆状病毒表达载体pFastBacTMDual的2个多克隆位点处,构建出重组载体pFast BacTMDual+[DR1/Fc].对构建的载体进行PCR及限制性内切酶酶切鉴定和测序.采用脂质体转染方法将表达载体转入昆虫细胞系Sf9中,通过双抗夹心ELISA及Western blot检测HLA-DR1的表达.结果 PCR及酶切鉴定和测序证实目的基因插入正确且序列与GenBank一致.ELISA和Western blot检测表明DR1杆状病毒感染的Sf9细胞培养上清HLA-DR1表达呈阳性,且表达的HLA-DR1分子具有正确的构象.结论 成功构建出杆状病毒表达载体pFastBacTMDual+[DR1/Fc],并在Sf9细胞中得到表达,为研究HLA-DR1限制性的T细胞应答奠定了基础.