K562-DC融合瘤苗刺激的CIK/NK细胞在荷瘤NOD/SCID小鼠体内的杀瘤活性

目的 探讨经K562细胞-树突细胞(DC)融合瘤苗刺激的脐血源性细胞因子诱导的杀伤(CIK)/自然杀伤(NK)细胞在荷瘤NOD/SCID小鼠体内的杀伤效能及其安全性.方法 通过不同细胞因子的组合分别诱导脐血单个核细胞(MNC)成为DC和CIK/NK细胞,通过聚乙二醇(PEG)将灭活K562细胞与DC融合形成K562-DC融合瘤苗.以10:1比例在CIK/NK细胞培养体系中加入K562-DC融合瘤苗,制备K562-DC融合瘤苗刺激的CIK/NK细胞.小鼠均经尾静脉接种K562细胞1×106诱导荷瘤鼠;于接种肿瘤细胞后24 h按不同分组分别经尾静脉输注K562-DC融合瘤苗刺激的CIK/NK细胞1×107、CIK/NK细胞1×107,同时设相应的非荷瘤鼠对照.比较各组小鼠的生存率、存活时间;用流式细胞术检测小鼠外周血、肝、肺组织中人CD13+细胞和外周血人CD56+细胞.结果 在接种1×106K562细胞后未经处理的小鼠39 d内全部死亡,8只鼠中肉眼可见瘤块的小鼠5只,其中位于肝脏的4只、脾脏的1只.接种K562细胞后接受K562-DC瘤苗刺激的CIK/NK细胞治疗的8只小鼠第65天时死亡1只,抗瘤有效率为87.5%;接受CIK/NK细胞治疗小鼠死亡2只,时间分别为接种K562细胞后第56天及第62天,抗瘤有效率为75.0%,均未发现肉眼可见瘤块.该两组小鼠存活时间分别为(69.4±1.8)d、(67.2±5.3)d,两组间差异无统计学意义(P＞0.05),均高于未予治疗的荷瘤对照组[(30.4±4.6)d](P＜0.01),荷瘤后接受K562-DC瘤苗刺激的和未经瘤苗刺激的CIK/NK细胞治疗的两组其余小鼠存活均超过70 d.经CIK/NK细胞治疗的两组存活小鼠外周血,肝、肺组织中人CD13+细胞率差异无统计学意义,均显著低于荷瘤未治疗组(P＜0.01),而治疗的两组存活小鼠外周血人CD56+细胞率与输注不同CIK/NK细胞的非荷瘤对照组相比差异无统计学意义(P＞0.05).结论 经过灭活肿瘤细胞预孵育的脐血源性CIK/NK细胞接种在动物体内具有抗瘤活性,无致瘤性.     

自组装peptide胶对神经干细胞在大鼠急性损伤脊髓中细胞分化的影响

目的 观察自组装peptide胶对神经干细胞(NSCs)在大鼠急性期损伤脊髓中的细胞分化的影响.方法 分离、培养和鉴定大鼠NSCs与自组装peptide胶共培养;SD大鼠25只采用NYU-Ⅱ型脊髓打击器制作T10脊髓损伤模型;急性期于损伤脊髓区分别行注射移植,其中联合细胞移植组(n=10)、单纯细胞移植组(n=10)及对照组(n=5).术后第2、4、8周取损伤部位脊髓,免疫组织化学染色检测移植细胞的分化.结果 成功建立大鼠NSCs的体外培养体系;移植的NSCs在大鼠脊髓内存活超过8周,单纯移植组、细胞分化比例较低,分化的NSCs主要为表达胶质纤维酸性蛋白(GFAP)抗原细胞,未见NSCs分化为表达微管相关蛋白(MAP2)标志抗原细胞;联合移植组,细胞分化比例较高;NSCs可分化为表达MAP2、Oligo、GFAP标志抗原细胞.结论 自组装peptide胶能够提高神经干细胞在大鼠急性期损伤脊髓中的分化比率,并有部分细胞可分化为表达神经元特异抗原的细胞.     

通用型脊髓打击器的研制与脊髓损伤动物模型的建立

目的:研制一种通用型脊髓打击器;并评估其制作脊髓分级挫伤动物模型的稳定性.方法:依据重物坠落致伤原理;设计一种通用型脊髓打击器;将50只SD大鼠;分为3个实验组和1个对照组;实验组应用该打击器以质量为20g的打击棒在不同高度实施打击:12.5mm组(A组;n=12);25mm组(B组;n=12);50mm组(C组;n=14);对照组仅行椎板切除;不打击(n=12);分别于术前、术后第2天、1周至6周进行大鼠BBB运动评分.方差分析比较各组各时间点的BBB评分;术后1周和6周取材行组织学观察;用Photoshop CS软件直方图命令处理连续切片中最大受损面积的图像;计算大鼠脊髓最大受损面积比;对BBB评分与大鼠脊髓最大受损面积比进行相关分析.取4只国产家猪;应用该打击器以50g×150mm打击能量打击后制备胸髓半侧挫伤模型;于术前、术后第2天和第7天行改良Tarlov分级法评价猪后肢功能;并进行组织学观察.结果:通用型脊髓打击器能够准确定点、定高打击制作动物脊髓损伤模型.大鼠分级脊髓挫伤模型在各个时间点上BBB评分差异有统计学意义(P＜0.05);A组和B组在术后1周后肢功能有不同程度恢复;而C组至术后6周均无明显恢复;对照组无功能障碍.大鼠和猪脊髓组织学表现均为以打击震中为中心的离心纵向损伤.大鼠脊髓最大受损面积比在各损伤组组内齐同、组间差异有统计学意义(P＜0.05);脊髓最大受损面积比与BBB评分呈密切负相关关系(r=0.89807;P＜0.001).猪脊髓半侧挫伤后Tarlov分级法评价显示为中重度损伤.结论:研制的通用型脊髓打击器可成功建立不同损伤程度、稳定性高的大鼠急性脊髓挫伤模型;并可用于建立猪脊髓挫伤模型.     

TNF-α诱导滑膜MSCsMSCs与BMSCs凋亡的比较研究

目的通过比较TNF-α诱导滑膜MSCs(synovium-derived MSCs,SMSCs)与BMSCs凋亡,探讨SMSCs的抗凋亡能力。方法取患者自愿捐赠的滑膜组织及骨髓,分别采用组织贴壁法和密度梯度离心法分离培养SMSCs和BMSCs并传代,取第3~5代细胞行细胞免疫表型及三系分化鉴定后进行实验。实验分为4组,其中SMSCs、BMSCs凋亡诱导组(SMSCs、BMSCs实验组)用20 ng/m L TNF-α和10μg/m L放线菌酮对细胞进行凋亡诱导,其对应对照组以正常培养基培养。倒置相差显微镜下观察凋亡诱导细胞形态变化;培养24 h取各组细胞,采用细胞计数试剂盒8及流式细胞术检测细胞存活率及凋亡率,Western blot法检测细胞半胱氨酶天冬氨酶蛋白酶降解产物8、3(Cleaved Caspase-8、3)的表达。结果经细胞表型及三系分化鉴定培养获得的细胞均符合MSCs鉴定标准。倒置相差显微镜观察示,随凋亡诱导培养时间延长,两实验组细胞形态及生长均较对应的对照组差。培养24 h,两对照组细胞存活率均为100%,未见细胞凋亡;SMSCs、BMSCs实验组细胞存活率分别降至60.13%±8.63%及46.55%±10.54%,均显著低于对照组(P0.05),SMSCs实验组细胞存活率显著高于BMSCs实验组(t=3.152,P=0.006)。SMSCs和BMSCs对照组细胞凋亡率分别为1.12%±0.24%和1.35%±0.31%,两实验组分别增高至36.54%±8.63%及53.77%±11.52%,均显著高于对照组(P0.05),且SMSCs实验组细胞凋亡率显著低于BMSCs实验组(t=3.785,P=0.001)。两对照组细胞Cleaved Caspase-8、3蛋白几乎不表达,且SMSCs实验组和BMSCs组细胞Cleaved Caspase-8、3蛋白明显高表达;其中BMSCs实验组明显高于SMSCs实验组(t=13.870,P=0.000;t=7.309,P=0.000)。结论经TNF-α诱导培养,SMSCs凋亡明显少于BMSCs,具有更强的抗凋亡能力。     

人胚胎神经干细胞延迟移植对脊髓损伤大鼠运动功能的影响及其机制

目的:初步探讨人胚胎神经干细胞(human fetal neural stem cells,hfNSCs)延迟移植对脊髓损伤大鼠运动功能的影响及其机制。方法:体外分离、培养和鉴定hfNSCs,选取200~250g的Wistar大鼠28只建立T9~T11节段脊髓挫伤模型,损伤后第9天取20只BBB评分为4~5分的大鼠随机分为对照组及移植组(每组10只),同时在T10水平脊髓中线两侧1.5mm处分别给予2μl不含hfNSCs的杜氏磷酸缓冲液(DPBS)及2μl含有105个体外培养第2代hfNSCs的DPBS,细胞移植后第7、14、28、42、56天用BBB评分评价两组后肢运动功能,移植后第28天及第56天用免疫组织化学法检测移植组大鼠损伤脊髓局部神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、微管相关蛋白2(MAP2)和2′,3′-环腺苷酸-3′-磷酸二酯酶(CNPase)的表达情况,以评价大鼠损伤脊髓局部hfNSCs的存活及分化情况。移植后第56天髓磷脂碱性蛋白(MBP)染色及透射电子显微镜扫描观察移植组与对照组损伤局部髓鞘形成情况。结果:体外培养的hfNSCs表达Nestin,并可分化为星形胶质细胞[(61.2±1.6)%]、神经元[(27.6±3.4)%]及少突胶质细胞[(6.0±5.5)%]。移植前及移植后第7、14天两组BBB评分比较无统计学差异(P>0.05),移植组在移植后第28、42、56天评分(分别为8.30±1.07分,11.30±1.05分,15.10±1.12分)较对照组(分别为7.00±0.98分,8.30±1.02分,9.10±0.96分)明显提高(P<0.05)。在移植后第28天hfNSCs可分化为GFAP阳性的星形胶质细胞、MAP2阳性的神经元和CNPase阳性的少突胶质细胞,在移植后第56天hfNSCs仍在损伤局部存活并可分化为星形胶质细胞和少突胶质细胞,但未见神经元分化;移植后第56天星形胶质细胞的积分光密度(IOD)值(1502.31±131.92)大于移植后第28天(628.98±119.31)(P<0.05),而少突胶质细胞在移植后第28天及第56天的变化无统计学差异。移植后第56天MBP染色证实人源性少突胶质细胞参与损伤区髓鞘的形成,透射电子显微镜扫描结果显示移植组有完整和连续的髓鞘形成,对照组髓鞘呈断裂及畸形表现。结论:hfNSCs延迟移植可促进脊髓损伤大鼠运动功能的恢复,其机制可能与促进损伤局部髓鞘的形成有关。     

反义pEGFP-C1-Survivin对骨肉瘤细胞生物学行为的影响

目的 观察Survivin反义核酸载体对人骨肉瘤细胞株MG-63生物学行为的抑制效应,并探讨其机制.方法 MTY检测转染前后MG-63细胞增殖抑制率的变化,Boyden小室体外侵袭实验测定转染前后侵袭能力变化.逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测转染前后Ang-2基因mRNA表达的变化.结果 噻唑蓝(MTT)检测显示转染后骨肉瘤细胞增殖明显受抑制,转染组抑制率达到23.4%,与各对照组之间差异有统计学意义(P<0.01),脂质体组、空质粒组和空白组之间差异无统计学意义(P>0.05).RT-PCR分析显示转染组MG-63中Ang-2基因mRNA的表达较转染前明显下降,与其他组之间差异有统计学意义(P<0.01),而另3组之间差异无统计学意义(P>0.05).Boyden小室体外侵袭实验测定显示转染组侵袭百分数为17.9%,与其他各组间差异有统计学意义(P<0.01).结论 Survivin反义核酸可以显著抑制人骨肉瘤细胞株MG-63的增殖、侵袭能力,部分逆转其恶性表型,这可能与其下调Ang-2的表达有关.     

颈髓弥散张量成像在肌萎缩性侧索硬化诊断中的应用

目的 初步探讨颈髓弥散张量成像(DTI)在肌萎缩性侧索硬化(ALS)诊断中的应用价值. 方法 选择自2000年1月至2007年1月中山大学附属第二医院骨科收治的28例ALS患者为患者组,20例同期门诊查体健康成年人为对照组,对2组成员进行常规MRI扫描及DTI检查,获取颈髓MD值及FA值的直方图,并对ALS患者颈髓DTI弥散张量值与患者ALS残损功能评分量表(ALSFRS)评分进行相关性分析. 结果 与对照组相比,患者组颈髓FA值和颈髓横断面积明显降低,差异有统计学意义(P<0.05);MD值轻微增加,差异无统计学意义(P>0.05).患者颈髓FA值与ALSFRS评分高度相关(r=0.730,P=0.000),与MD值等指标无相关关系. 结论 ALS患者颈髓DTI显像FA值显著降低,FA值可能成为ALS诊断中的神经影像学阳性支持指标:颈髓的弥散张量值与ALSFRS结合,可以更伞面反映ALS患者的病情进展.     

鼠尾胶原三维诱导E14小鼠胚胎干细胞分化为甲状腺类似细胞的初步研究

目的 在体外贴壁诱导E14小鼠胚胎干细胞分化为甲状腺细胞的基础上,不改变诱导因子,探索鼠尾胶原三维结构体外诱导胚胎干细胞分化为甲状腺细胞的可行性.方法 E14小鼠胚胎干细胞半固体培养基悬浮培养6 d生成拟胚体,随后在鼠尾胶原三维结构中继续诱导分化11d,全程添加诱导因子促甲状腺素及胰岛素,第14天时开始添加碘化钾.结果 拟胚体在鼠尾胶原上生长状态良好,分化细胞贴壁后逐渐陷入鼠尾胶原;电镜下诱导细胞高尔基体、内质网丰富,部分诱导细胞胞质内见不典型分泌颗粒,与人成体甲状腺细胞超微结构类似.结论 胚胎干细胞在鼠尾胶原三维结构中可以分化为甲状腺类似细胞,并具备合成、分泌的功能;三维结构为体外诱导胚胎干细胞分化为甲状腺细胞提供了新的方法.     

人脐血间充质干细胞促进脐血CD34+细胞在NOD/SCID小鼠体内植入的实验研究

目的探讨人脐血间充质干细胞(MSC)联合人脐血CD34+细胞移植,能否促进CD34+细胞在NOD/SCID小鼠体内植入及加速其造血恢复.方法NOD/SCID小鼠于60Co 2.5 Gy照射后24h内由尾静脉输注胎儿脐血CD34+细胞1×105/只(低细胞量移植组)或1×106/只(高细胞量移植组),联合移植组同时输注脐血MSC 1×106/只.动态观察移植后小鼠外周血白细胞、血红蛋白和血小板恢复情况,于移植后第8周用流式细胞术检测存活小鼠骨髓中人CD45+、CD45+CD3+、CD45+CD19+和CD45+CD33+细胞的含量.结果①低细胞量移植时,联合移植组的植入率明显高于单纯移植组,分别为26.02%和16.52%(P＜0.05);高细胞量移植时,联合移植组和单纯移植组的植入率相近,分别为43.71%和39.23%(P＞0.05).②高细胞量联合移植组和单纯移植组的存活率分别为80%和70%;低细胞量联合移植组和单纯移植组的存活率分别为70%和50%.③无论高细胞量还是低细胞量组,联合移植小鼠白细胞、血红蛋白和血小板的恢复明显早于单纯移植组.④移植8周后,小鼠骨髓中人CD45+CD19+、CD45+CD33+细胞含量在低细胞量移植时,联合移植组高于单纯移植组;但在高细胞量移植时,两组之间差异无统计学意义.CD45+CD41a+细胞的含量无论在低细胞量和高细胞量移植时,联合移植组均高于单纯移植组.各组小鼠骨髓中CD45+CD3+细胞的含量均较少,且各组之间差异无统计学意义.结论①低细胞量移植时,人脐血MSC联合移植可提高人脐血CD34+细胞在小鼠体内的植入率.②人脐血MSC与人脐血CD34+细胞联合移植,加速NOD/SCID小鼠各系造血恢复,提高移植小鼠存活率.③MSC联合移植可促进人脐血CD34+细胞在NOD/SCID小鼠体内向粒系、B淋巴系和巨核系定向分化.     

脐血移植发生移植物抗宿主病与T细胞表达CD94的关系

背景:据作者检索脐血移植中有关T细胞表达CD94与移植后发生急,慢性移植物抗宿主病的关系尚无报道.目的:初步探讨T细胞表达CD94在脐血移植免疫耐受中的作用.设计:病例-对照分析.对象:1999-01/2007-06中山大学附属第二医院造血干细胞移植中心行脐血移植的14例患儿,年龄2～9岁,中位年龄6.8岁;接受HLA全相合血缘相关脐血移植患儿9例,接受无关供者脐血移植5例.同时选取体检正常的34例儿童外周血标本作为对照,由中山大学附属二院儿科提供,男18例,女15例,平均年龄4.5岁.方法:抽取正常儿童外周静脉血2 mL,14例患儿均在脐血移植后造血恢复至中性粒细胞绝对数≥0.5×109 L-1时开始采集外周静脉血2 mL,血液样奉均置于EDTA-2Na抗凝管,待测细胞表面抗原.每1～3个月榆测1次,至随访结束.所有样本在6 h内完成标定,均采用双色和三色直接免疫荧光标记法,流式细胞仪检测外周血T细胞表面CD94的表达.主要观察指标:脐血移植后移植物抗宿土病的发生.移植物抗宿主病与外剧血T细胞表面CD94表达的关系.结果:9例接受同胞脐血移植的患儿中,有6例未发生急性移植物抗宿主病,其余3例及接受非血缘相关脐血移植的5例患儿均于移植后6 d-50 d发生急性移植物抗宿丰病,5例患儿发生慢性移植物抗宿主病.与正常对照比较,全部脐血移植患儿CD3 CD4 CD94 T细胞、CD3 CD8 CD94 T细胞的表达均明显升高(P＜0.05).与未发发急性移植物抗宿主病患儿比较,急,慢性移植物抗宿主病患儿CD3 CD4 CD94 T细胞、CD3 CD8 CD94 T细胞的表达均明显升高(P＜0.05).结论:脐血移植后发生急,慢性移植物抗宿主病时T细胞高表达CD94,提示T细胞CD94分子的活化参与了移植物抗宿主病的发生.