细胞因子诱导杀伤细胞／自然杀伤细胞培养过程中CD16及CD11a的表达变化

背景:由于细胞因子诱导杀伤细胞、自然杀伤细胞上表达的CD16和CD11a均与其介导的抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用和直接接触杀伤的抗肿瘤效应密切相关.因此了解两种细胞扩增过程中这两种分子表达的强弱,对根据免疫效应细胞的最终用途决定两种细胞的最佳收获时机具有重要意义.目的:了解细胞因子诱导杀伤细胞和自然杀伤细胞在培养过程中的CD16和CD11a表达的变化规律.设计、时间及地点:细胞移植免疫学动态观察,于2006-09/2008-03在中山大学附属第二医院完成.材料:脐血来自本院健康足月妊娠产妇.方法:采用Ficoll-Hypaque法分离脐血单个核细胞,接种于含体积分数为0.15胎牛血清的IMDM,双抗生素青、链霉素各1×105U/L24孔培养板中,在培养体系中加入白细胞介素2、白细胞介素7、白细胞介素15、干细胞因子及FLT3L制备细胞因子诱导杀伤细胞和自然杀伤细胞,每隔3天半量换液及全量补充上述细胞因子.主要观察指标:流式细胞仪榆测CD3+CD56+细胞因子诱导杀伤细胞以及CD3-CD56+自然杀伤细胞在4周培养过程中CD16和CD11a表达的变化.结果:CD16在细胞因子诱导杀伤细胞、自然杀伤细胞上的表达随着培养时间的延长逐渐增加,在两类细胞上均在培养的第4周达到最高峰,分别为(55.99±3.90)%和(7.86±1.66)%,但CD16存自然杀伤细胞上表达比例较低,整个培养过程中自然杀伤细胞上CD16的均数表达没有超过8%.CD11a在细胞因子诱导杀伤细胞培养的第3周,自然杀伤细胞培养的第2周达到最高峰,分别为(49.32±6.32)%和(82.31±11.33)%,之后逐渐出现下降,到培养第4周几乎消失.结论:CD16和CD11a在细胞因子诱导杀伤细胞和自然杀伤细胞上的表达随培养时间呈动态变化,使用单克隆抗体联合细胞因予诱导杀伤细胞介导的抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用效应时,细胞的收获期可在细胞培养的第4周,利用细胞因子诱导杀伤细胞和自然杀伤细胞的直接杀伤效应进行细胞过继免疫,那么收获细胞的时间以细胞培养的第3周为宜.     

CD80，CD86和ICAM-1在急性白血病细胞上的表达及意义

目的通过流式细胞术检测初诊患者急性自血病细胞上共刺激分子CD80、CD86以及黏附分子ICAM．1的表达，以了解其表达规律。方法通过流式细胞仪检测60例初治急性白血患者白血病细胞上CD80、CD86和ICAM-1的表达率；男37例，女23例，年龄2～85岁，中位年龄28岁；其中ALL20例，AML40例（M16例、M27例、M37例、M415例、M55例）。结果ALL组中的CD86的表达为（32．880±6．665）％，显著高于正常对照（P〈0．01），而CD80与正常BM对照比较无统计学意义；CD80、CD86在AML（M1、M2和M3）细胞上的表达分别为（0．766±0．187）％、（27．210±7．581）％，均显著高于相应的正常骨髓对照（P〈0．01）；在AML（M4和M5）细胞上CD80、CD86的表达与正常对照比较均无统计学意义。ICAM-1在ALL组中的表达与正常BM对照比较无统计学意义；在AML（M1、M2和M3）细胞上（63．820±7．484）％，显著高于相应的正常骨髓对照（P〈0．01）：而AML（M4和M5）细胞上表达为（50．590±7．092）％，显著低于相应的正常骨髓对照（P〈0．01）。结论CD80、CD86和ICAM．1在初治ALL和AML白血病细胞上的表达呈一定变异性，CD86在ALL上呈高表达，CD80、CD86和ICAM-1在AML（M1、M2和M3）上均呈高表达，而ICAM-1在AML（M4和M5）上均呈低表达。     

恩再适治疗神经病理性疼痛的临床应用

目的评价恩再适治疗神经病理性疼痛的疗效。方法选择25例神经病理性疼痛的患者,每个患者给予恩再适9ml加入0.9%生理盐水250ml中静脉滴注,1次/日,连续14天,在用药前,用药后第1天、第7天和第14天用VAS10分法检测神经病理性疼痛的缓解程度。结果用药后第1天,疼痛改善不明显;第7天开始,恩再适明显缓解神经病理性疼痛;本次观察显效率68.85%,总有效率92.5%。有1例患者出现皮疹,停药后皮疹逐渐消失。结论恩再适治疗神经病理性疼痛有效率较高,安全性较好。     

脐血来源DCs对CIK、NK细胞杀伤活性影响的实验研究

[目的]探索同一来源脐血树突状细胞(DCs)以不同刺激方式作用于细胞因子诱导杀伤(CIK)、自然杀伤(NK)细胞后对其杀伤活性的影响.[方法]通过细胞因子组合诱导、扩增脐血来源的DCs、CIK和NK细胞,分别将DCs以不同的刺激方式(提前共孵育或直接加入)作用于同一来源的脐血CIK、NK细胞,了解其对不同效靶比下CIK、NK细胞杀伤K562、HL-60细胞株细胞毒活性的影响.[结果]随着效靶比的升高,脐血CIK、NK细胞对肿瘤细胞株的杀伤力增加,将脐血DCs与CIK、NK细胞共孵育或杀伤时直接加入,均可显著提高CIK、NK细胞的细胞毒活性,以杀伤时直接加入DCs的促进作用更强.[结论]直接加入DCs对促进CIK、NK细胞对肿瘤细胞的杀伤作用更为有效.     

脐血移植治疗重型β地中海贫血的追踪观察

黄绍良等曾报道国内首例脐血造血干细胞移植(UCBT)成功治疗重型β地中海贫血。在移植后小儿呈嵌合体的“脱地中海贫血状态(ex-thalassemia脱地贫)”的追踪观察中,我们发现本例嵌合状态在临床表现、血红蛋白(Hb)量、Hb种类的动态改变,有一定的时空顺序,与骨髓移植治疗本病时的临床和实验结果有明显区别。特总结如下:对象和方法一、病例资料患儿男,4.5岁,汉族。生后6个月起渐出现进行性面色苍白,Hb呈进行性下降,1岁时查Hb为33g/L,肝肋下4cm,脾肋下5cm,HbA20.018,HbF0.58,β地贫基因为β41-42(-TCTT)纯合子;父母均为β41-42杂合子,2岁半…     

重组腺病毒载体Ad-LMP-1的构建及其转染 MSC后成骨活性

 【目的】 快速构建大鼠LIM矿化蛋白-1基因重组腺病毒载体,转染MSC,探讨LMP-1基因对MSC成骨分化和成骨活性的影响｡ 【方法】 从大鼠成骨细胞内提取总RNA,并设计LMP-1特异性引物进行RT-PCR,获取LMP-1基因后利用Invitrogen公司的TOPO定向克隆技术创建入门克隆pENTR/D-LMP-1｡转化TOP10细菌后,挑取阳性克隆摇菌提取质粒,入门克隆再与表达载体pAD/CMV/V5-DEST进行同源重组反应得到病毒载体pAD/CMV/V5-LMP-1,转化细菌后挑选阳性克隆摇菌提取重组病毒质粒,用PacI内切酶线性化后用转染293A细胞后得到重组腺病毒载体｡以腺病毒为载体,将大鼠LMP-1基因体外转染于3代大鼠MSC细胞内,检测LMP-1基因在MSC细胞的表达,分别观察转染后实验组与对照组I型胶原､碱性磷酸酶､骨钙素表达变化以及骨钙结节的形成情况,评价LMP-1基因的成骨能力｡【结果】 成功获取大鼠LMP-1基因,入门质粒与病毒表达质粒经过酶切鉴定以及测序验证｡LMP-1基因能在MSC中高效表达,转然后MSC的I型胶原,碱性磷酸酶､骨钙素的表达明显增强,骨钙结节形成增多｡ 【结论】 利用Gateway 技术构建LMP-1重组腺病毒载体相对简单,可快捷获得的pAd-LMP-1｡pAd-LMP-1转染MSC后,LMP-1基因能促进MSC向成骨细胞分化,增强其成骨作用｡     

人脐血来源MSCs的主要生物学特性的研究

目的：探讨人脐血间充质干细胞（MSCs）分离、纯化、扩增、表面标志、免疫表型及其造血生长因子（HGFs）分泌等生物学特性方法：(1) Ficoll法分离、纯化人脐血、成人骨髓和胎儿骨髓MSCs，动态观察不同来源MSCs的生长状况。(2) 流式细胞仪检测脐血和骨髓MSCs表面CD34、CD45、CD14、CD29、CD44、CD105、CD166、CD80、CD86、CD40和CD40L的表达。(3) ELISA法检测脐血和骨髓MSCs培养上清中SCF、TPO、FLT-3L和IL-6的分泌水平。结果：(1) 所有骨髓标本中均可分离纯化出MSCs，而15份脐血中仅4份分离纯化出MSCs，脐血MSCs和骨髓MSCs的细胞形态无明显差异,脐血MSCs原代培养所需要的单个核细胞（MNC）量为骨髓MSCs的3倍，且其原代培养的增殖速度较慢，但脐血MSCs传代培养的增殖速度和骨髓相似。(2) 脐血MSCs和骨髓MSCs表面标志无差异，均不表达造血细胞表面标志以及与免疫识别有关的表面抗原。(3) 脐血和骨髓MSCs分泌SCF、TPO、FLT-3L和IL-6的水平相似。结论： (1)脐血和骨髓同样可以分离、纯化MSCs，但脐血中MSCs的含量少，且大部分脐血中不含MSCs。(2)纯化的脐血MSCs扩增能力、表面标志、免疫学表型及HGFs分泌水平和骨髓MSCs相似。     

最优化细胞因子诱导杀伤细胞/自然杀伤细胞 少因子培养体系的探索

 【目的】 尝试使用IL-2、IL-7和IL-12的单因子、双因子和三因子组合进行杀伤细胞/自然杀伤细胞(CIK/NK)细胞扩增培养,探讨最优化CIK/NK细胞少因子培养体系的建立.【方法】 采用Ficoll-Hypaque法分离脐血单个核细胞并分成6组,每组分别加入IL-2(80 ng/mL)、 IL-7(40 ng/mL)及IL-12(40 ng/mL)的单因子、双因子和三因子组合(IL-7组;IL-12 组;IL-7+IL-12组;IL-2 + IL-7组;IL-2 + IL-12组;IL-2 + IL-7 + IL-12组),每组6个重复孔,共培养21 d收获细胞。在细胞培养开始和第21天,实验各组取细胞悬液进行流式细胞仪检测CD3+ CD56 + CIK细胞及CD3- CD56+ NK细胞比例。【结果】 单因子培养体系的IL-12组在CIK细胞扩增比例上是各组中最高的(22.96 ± 1.41)%,双因子体系的IL-2 + IL-12组的CIK细胞扩增比例也达到(18.58 ± 0.68)%;上述两组的CIK细胞扩增比例已经达到或基本达到使用传统多因子扩增方法所获得的比例&;#65377;IL-12组的NK细胞扩增比例为(30.23 ± 1.18)%,IL-2 + IL-7组的NK细胞扩增比例也达(29.52 ± 0.89)%。 【结论】 使用IL-12、IL-2 + IL-12或IL-2 + IL-7组合的少因子培养体系进行CIK/NK细胞的培养扩增是可行的。     

脐血间充质干细胞的生物学特性及其成骨细胞定向诱导

目的:研究人间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cells,MSCs)的定向分化为成骨细胞的条件及其成骨活性.方法:采用标准Ficoll-Hypaque技术分离脐血和成人骨髓MSCs,以地塞米松、β-磷酸甘油和维生素C为辅剂定向诱导成骨细胞,碱性磷酸酶、骨矿化结节和Ⅰ型胶原作为成骨细胞鉴定与活性评价的指标.结果:两种MSCs的细胞形态和生物学特性无明显差异.定向成骨细胞诱导后,成骨细胞标志性产物碱性磷酸酶、骨矿化结节和Ⅰ型胶原均得到了稳定的表达,并显著高于未诱导MSCs.结论:脐血和成人骨髓MSCs在适当的条件下均可向成骨细胞定向转化.     

麻疹疫苗反复注射对哮喘患儿IL-12、IL-13水平的影响

目的与方法:通过观察轻-中度发作期哮喘患儿麻疹疫苗反复注射前后IL-12,IL-13及血清总IgE水平的变化,探讨麻苗治疗对哮喘患儿的免疫影响及其治疗小儿哮喘的作用机制。采用生物素-亲合素双抗夹心酶联免疫(ABC-ELISA)法测定麻苗治疗前后13例哮喘患儿(麻苗治疗组)血浆及外周血单个核细胞(PBMC)培养上清中的IL-12、IL-13与血清总IgE水平,并与12例单纯对症治疗组哮喘患儿及17例正常对照组小儿比较。结果:麻苗治疗后,IL-12水平与对症治疗组无显著差异(P＞0.05),IL-13与血清总IgE水平显著降低(P＜0.05)。血浆IL-12水平与血清总IgE水平呈负相关(r=-0.437,P＜0.05),PBMC培养上清中的IL-12水平与血清总IgE水平无相关性;血浆及PBMC培养上清中的IL-13水平与血清总IgE水平呈正相关(r=0.657及r=0.485,P＜0.01);血浆及PBMC培养上清中的IL-12水平与IL-13水平呈负相关(r=-0.460及r=-0.383,P＜0.05)。结论:麻疹疫苗反复注射是通过下调哮喘患儿IL-13水平,进而降低血清总IgE水平,而对IL-12水平无显著影响。