地中海贫血患儿血清特异性群体反应性抗体对脐血造血干细胞增殖、分化能力的影响

背景:已有报道证实群体反应性抗体在实体器官移植受者排斥反应中起着重要作用,并且与植入物功能衰竭呈正相关。目的:实验拟观察反复输血地中海贫血患儿血清中特异性群体反应性抗体对脐血造血干/祖细胞增殖、分化能力的影响。设计、时间及地点:体外细胞学实验,于2006-01/2007-08在中山大学附属第二医院医学研究中心完成。材料:5份健康足月产妇脐带血,每份80~100mL。反复输血地中海贫血患儿的群体反应性抗体血清样本。5份健康儿童AB分型血清样本。6份阳性抗凝静脉血样本10mL。方法:采用聚蔗糖-泛影葡胺梯度离心法分离脐带血单个核细胞。将1×105脐血单个核细胞与分别与健康儿童AB血清50μL、0,50,100μL不同浓度群体反应性抗体血清混合后,再将上述细胞混合物与兔补体共同孵育进行半固体集落培养。主要观察指标:倒置显微镜下观察并计数共培养第7,14天总集落数和各种集落数。结果:脐血造血干/祖细胞受群体反应性抗体血清作用后,其半固体集落培养的总集落数以及各种集落数均有不同程度的下降,其中总集落数和粒单系集落形成单位的下降数,经统计学处理差异具有显著性意义(P<0.01);群体反应性抗体血清量与总集落、粒单系集落形成单位、粒红单核巨核系集落形成单位、红系爆式集落形成单位、巨核系爆式集落形成单位、巨核系集落形成单位之间的肯德尔相关分析呈负相关,经统计学处理差异有显著性意义(P<0.05)。结论:特异性群体反应性抗体对脐血造血干/祖细胞的增殖、分化能力具有抑制作用,并且抑制作用与群体反应性抗体剂量相关:群体反应性抗体剂量越大,抑制作用越强。     

检测K562和Raji-树突状细胞融合瘤苗的价值

目前 ,树突状细胞 (dendriticcell,DC)在免疫调节中的作用广受关注。将完整肿瘤细胞直接和DC融合得到的肿瘤细胞DC融合瘤苗 ,不但可表达肿瘤抗原 ,还可表达共刺激分子 ,使肿瘤抗原得以有效呈递[1 ] 。DC融合瘤苗制备明显比基因修饰及肿瘤细胞疫苗简便 ,其融合效率多通过特定的次黄嘌呤 氨基喋呤 胸腺嘧啶 (hypoxathine aminopterin thymidine,HAT)培养基筛选或活细胞双标记荧光染色进行判断。但前者必需是次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转换酶(HGPRtase)缺陷型的实验细胞株 ,而后者操作复杂 ,实际应用难度较大。本研究使用流式细胞术对经聚…     

IL-2和IL-15刺激脐血NK细胞对K562/Jurkat细胞的杀伤活性研究

本研究旨在探讨脐血(cord blood,CB)NK细胞的杀伤功能及细胞因子IL-2和IL-15对NK细胞杀伤K562/Jurkat细胞活性的影响。采用autoMACS及CD3阴选后CD56阳选两步免疫磁珠分选法从脐血单个核细胞纯化NK细胞,分选后NK细胞用流式细胞仪测定纯度,通过IL-2及IL-2和IL-15两种细胞因子组合培养3天,用LDH释放法检测培养前后脐血NK细胞对白血病细胞株K562和Jurkat的细胞毒活性(效靶比10∶1),并记录不同细胞因子培养体系条件下NK细胞的生长状况。结果表明,CB-MNC中CD3-CD56+细胞含量为(14.88±9.2)%,分选后CD3-CD56+细胞含量为(92.39±0.8)%;培养3天后,IL-2组NK细胞形成集落数为148.60±13.0,IL-2复合IL-15组NK细胞形成集落数为831.80±23.0,两者比较,有显著性差异;以K562为靶细胞时,新鲜纯化CB-NK的杀伤活性为(27.76±8.8)%,IL-2组杀伤活性为(61.9±9.1)%,IL-2复合IL-15组杀伤活性为(87.62±3.7)%,差别有统计学意义;以Jurkat为靶细胞时,新鲜纯化CB-NK细胞的杀伤活性为(29.32±2.5)%,IL-2组杀伤活性为(69.43±4.4)%,IL-2复合IL-15组杀伤活性为(92.95±3.2)%,差别有统计学意义。结论:脐血新鲜纯化NK细胞对K562、Jurkat细胞有一定的杀伤作用,但自发细胞毒活性较低,IL-2/IL-15刺激后杀伤活性显著提高,IL-15复合IL-2对促进脐血NK细胞的生长和提高其细胞毒活性明显优于单用IL-2。     

间充质干细胞在致敏受者造血干细胞移植中的作用

【目的】 本实验拟研究骨髓间充质干细胞(MSC)在致敏受者造血干细胞移植中的作用?【方法】 体外分离BALB/c小鼠骨髓细胞,通过贴壁培养方法获得MSC,应用流式细胞仪检测细胞表面分子标记?通过异基因脾细胞输注方法建立致敏动物模型;绿色荧光染料标记骨髓MSC,分别移植到非致敏及致敏受者体内,并于移植后不同时间点检测MSC的归巢情况?致敏BALB/c小鼠经照射预处理,联合应用同基因MSC与异基因骨髓细胞移植,每日观察小鼠的生存情况?【结果】 体外培养第4代MSC表现为长梭形,阴性表达造血细胞表面分子而阳性表达粘附分子?动物体内实验发现移植后第48小时,MSC在非致敏受者体内主要归巢于骨髓,而在致敏受者体内主要归巢于脾脏?造血干细胞移植实验中,致敏小鼠接受同基因骨髓MSC与异基因骨髓细胞移植,结果发现致敏小鼠在移植后第12 ~ 16天全部死亡,生存中位数时间是14 d?【结论】 成功培养小鼠骨髓MSC;移植后MSC在致敏受者体内主要归巢于脾脏组织;联合应用MSC移植并不能有效促进异基因造血干/祖细胞在致敏受者体内植入?     

CIK/NK细胞4周培养过程中的CD27、CD28的表达及其意义

目的:了解细胞因子诱导杀伤（CIK）细胞和自然杀伤（NK）细胞在培养过程中CD27和CD28的表达变化规律。方法:通过流式细胞仪检测CD3+CD56+ CIK细胞以及CD3-CD56+ NK细胞在4周培养过程中其上CD27和CD28的表达变化。结果:CD27在CIK和NK细胞上均于培养的第2周达到最高峰,分别为（44.57±4.07）％和（51.02±5.20）％,但之后逐步下降,在培养第4周降至30%左右的水平。CD28在CIK和NK细胞上分别是在第3周和第2周时达到表达的最高峰,为（4.40±0.66）％和（45.14±3.58）％,之后迅速下降,在培养第4周已经几乎消失。结论:根据CD27和CD28在CIK/NK细胞上的表达变化规律,CIK/NK细胞的收获时机以培养第3周为宜。     

人神经干细胞移植对脊髓损伤大鼠后肢运动功能恢复的影响

目的:探讨人神经干细胞(hNSCs)移植对脊髓损伤大鼠后肢运动功能恢复的影响及可能机制。方法:取2～3个月流产胎儿海马区组织,体外培养神经干细胞;采用通用型脊髓打击器将24只成年SD大鼠制成脊髓损伤模型,伤后第8天随机分为移植组和对照组,于损伤中心分别注入CM-DiI标记的hNSCs悬液和DMEM/F12培养液。分别于hNSCs移植后当天及1、2、3、4、6、8周采用Basso,Beattie,Bresnahan(BBB)行为功能评定量表评估大鼠后肢运动功能恢复情况。移植后第4、8周取损伤部位脊髓,行病理切片,免疫组化方法观察移植细胞的存活和迁移,并检测损伤脊髓处胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、神经元核心抗原(NeuN)、2,3-环核苷酸磷酸二酯酶(CNPase)、神经巢蛋白(Nestin)等抗原的表达。结果:移植组后肢运动功能评分随时间延长而逐渐升高,移植1周时后肢运动功能有所改善,与对照组无明显差异(6.4±0.99 vs 6.0±0.93,P>0.05);移植4周时后肢运动功能比1周时有明显恢复,BBB评分明显高于对照组(9.7±1.04 vs 7.4±0.95,P<0.05);移植的hNSCs可在损伤脊髓处长时间存活(至少8周),并分化为神经元、少突胶质细胞和星形胶质细胞。结论:人神经干细胞可在损伤脊髓处向神经元和神经胶质细胞分化,并能促进脊髓损伤大鼠后肢运动功能的部分恢复。     

不同途径和时段输入人骨髓源间充质干细胞和脐血源CIK/NK细胞在NOD/SCID小鼠体内的分布规律及相互作用机制探讨

本研究探讨不同的输注途径以及不同的时段输注人骨髓源间充质干细胞(MSC)与脐血源CIK/NK细胞在NOD/SCID小鼠体内的分布规律及相互作用机制。输注前每毫升MSC悬液中加入5μl DiI染液(红色),每毫升CIK/NK细胞悬液中加入1μl CFDA SE染液(绿色)进行荧光标记。每只NOD/SCID小鼠的MSC的输注量为1×106(0.1ml),CIK/NK细胞为1×107(0.1ml)。实验分4为组,每组6只。A组:MSC+CIK/NK细胞同时静脉输注;B组:MSC+CIK/NK细胞静脉输注,CIK/NK细胞在MSC后48小时输注;C组:MSC髓腔输注+CIK/NK细胞同时静脉输注;D组:MSC髓腔输注+CIK/NK细胞静脉输注,CIK/NK细胞在MSC后48小时输注。CIK/NK细胞输注后24、48小时解剖NOD/SCID小鼠(每批次3只),分别取小鼠肝、脾、肺、肾脏进行冰冻切片,荧光显微镜下观察计数每低倍镜视野红色和绿色荧光细胞的平均数量及其平均比值关系,以反映MSC与CIK/NK细胞体内的相互作用及其对CIK/NK细胞抑制作用的强度。结果表明:输注CIK/NK细胞24小时和48小时后,A、B组小鼠肺、肝、脾中MSC与CIK/NK细胞平均比值之和均高于C、D组,而A组小鼠肺、肝、脾中MSC与CIK/NK细胞平均比值之和稍高于B组,但两组间无显著性差异;输注CIK/NK细胞24小时后C组小鼠肺、肝、脾中MSC与CIK/NK细胞平均比值之和稍低于D组,而48小时后其MSC与CIK/NK细胞平均比值之和稍高于D组,但两组间并无显著性差异。A、B、C、D4组小鼠在输注CIK/NK细胞24小时和48小时后肺、肝、脾中MSC与CIK/NK细胞的平均比值之和均高于肾脏。结论:相同部位、相同时段输注MSC与CIK/NK细胞时,两种细胞在体内发生相互作用,MSC在动物模型体内和CIK/NK细胞相互作用的场所可能主要位于肺部和肝脏等网状内皮系统。     

细胞因子诱导杀伤细胞／自然杀伤细胞培养过程中CD16及CD11a的表达变化

背景:由于细胞因子诱导杀伤细胞、自然杀伤细胞上表达的CD16和CD11a均与其介导的抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用和直接接触杀伤的抗肿瘤效应密切相关.因此了解两种细胞扩增过程中这两种分子表达的强弱,对根据免疫效应细胞的最终用途决定两种细胞的最佳收获时机具有重要意义.目的:了解细胞因子诱导杀伤细胞和自然杀伤细胞在培养过程中的CD16和CD11a表达的变化规律.设计、时间及地点:细胞移植免疫学动态观察,于2006-09/2008-03在中山大学附属第二医院完成.材料:脐血来自本院健康足月妊娠产妇.方法:采用Ficoll-Hypaque法分离脐血单个核细胞,接种于含体积分数为0.15胎牛血清的IMDM,双抗生素青、链霉素各1×105U/L24孔培养板中,在培养体系中加入白细胞介素2、白细胞介素7、白细胞介素15、干细胞因子及FLT3L制备细胞因子诱导杀伤细胞和自然杀伤细胞,每隔3天半量换液及全量补充上述细胞因子.主要观察指标:流式细胞仪榆测CD3+CD56+细胞因子诱导杀伤细胞以及CD3-CD56+自然杀伤细胞在4周培养过程中CD16和CD11a表达的变化.结果:CD16在细胞因子诱导杀伤细胞、自然杀伤细胞上的表达随着培养时间的延长逐渐增加,在两类细胞上均在培养的第4周达到最高峰,分别为(55.99±3.90)%和(7.86±1.66)%,但CD16存自然杀伤细胞上表达比例较低,整个培养过程中自然杀伤细胞上CD16的均数表达没有超过8%.CD11a在细胞因子诱导杀伤细胞培养的第3周,自然杀伤细胞培养的第2周达到最高峰,分别为(49.32±6.32)%和(82.31±11.33)%,之后逐渐出现下降,到培养第4周几乎消失.结论:CD16和CD11a在细胞因子诱导杀伤细胞和自然杀伤细胞上的表达随培养时间呈动态变化,使用单克隆抗体联合细胞因予诱导杀伤细胞介导的抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用效应时,细胞的收获期可在细胞培养的第4周,利用细胞因子诱导杀伤细胞和自然杀伤细胞的直接杀伤效应进行细胞过继免疫,那么收获细胞的时间以细胞培养的第3周为宜.     

延迟植入嗅神经鞘细胞对成鼠胸髓损伤修复的研究

目的 :观察嗅神经鞘细胞 (OECs)对成鼠损伤脊髓轴突再生的作用。方法 :将分离、培养的SD大鼠OECs移植于打击伤后 3d的SD大鼠脊髓组织中 (T1 0 ) ;对照组动物只注入DMEM /F1 2 (1∶1 )培养液 ;移植后 6周通过组织学和免疫组化方法观察OECs对脊髓轴突再生的影响。结果 :实验组OECs与宿主融合良好 ,细胞内及细胞周围有髓鞘碱性蛋白阳性物质存在 ,损伤区可见呈束状排列的再生轴突。对照组轴突变性 ,未见再生轴突。结论 :OECs延迟植入成鼠打击伤后的脊髓后 ,可存活并产生髓鞘样物质 ,促进宿主脊髓轴突再生     

雷帕霉素对人骨肉瘤细胞增殖和凋亡的影响

目的 观察雷帕霉素(RAPA)对人骨肉瘤细胞U-2OS和Saos-2增殖和凋亡的影响并探讨其机制.方法 体外培养骨肉瘤细胞株U-2OS和Saos-2;噻唑蓝(MTT)比色法和流式细胞仪检测不同浓度雷帕霉素对骨肉瘤细胞增殖和凋亡的影响;Western blot检测雷帕霉素作用后骨肉瘤细胞Fas蛋白表达的变化.结果 MTT检测显示雷帕霉素可抑制入骨肉瘤细胞增殖,在雷帕霉素浓度达到20 nmol/L时,抑制作用显著提高(P＜0.05),增殖抑制率分别达到31.2％和28.7％.流式细胞检测显示在雷帕霉素浓度达到20 nmol/L时,其诱导骨肉瘤细胞凋亡的作用显著增强(P＜0.05).Western blot检测显示经雷帕霉素作用48 h后的骨肉瘤细胞Fas蛋白的表达明显增强.结论 雷帕霉素对入骨肉瘤细胞株U-2OS和Saos-2的增殖有抑制作用并可诱导其发生凋亡,其可能是通过上调Fas蛋白的表达而发挥作用的.