大肠埃希菌O157：H7特异基因检测与毒力基因分析

目的：对江苏省2000和2001年分离的经血清玻片凝集试验初筛为大肠埃希菌O157：H7（E.coliO157:H7)的菌株进行O157O抗原及H7抗原特异性基因检测，了解2000年监测点宿主动物分离O157菌株毒力基因携带率及毒力基因图谱。方法：用聚合酶链反应法检测O157特异基因，H7特异基因，多重引物聚合酶链反应法检测VT1，VT2，eaeA,hly等毒力基因并进行分析。结果：134株血清玻片凝集试验初筛为E.coliO157:H7的菌株经特异基因检测确定为E.coliO157的占72.4%(97/134),E.coliO157:H7的仅为29.1%(39/134)；非O157菌株占26.9%(36/134)，有44.3%(58/134)的O157菌株鞭毛抗原不是H7。2000年宿主动物分离菌株，经特异基因检测为非O157的不携带毒力基因（0/18）；为E.coliO157:H?的菌株，毒力基因携带率为10.7%(3/28)；确定为E.coliO157:H7的菌株，毒力基因携带率高达93.1%(27/29)。且毒力基因型以VT2 eaeA hly为主。结论：特异性基因检测鉴定E.coliO157:H7，可大大减少血清玻片凝集试验的误判，结合毒力基因检测，可分析E.coliO157:H7菌株毒力基因型的变化，对制定切实有效的防制对策控制E.coliO157:H7流行具有重要意义。     

人源Fab抗体库的构建和抗HBsAg抗体的筛选和鉴定

目的 构建人源Fab抗体文库,筛选抗HBsAg 抗体片段并进行初步鉴定.方法 收集20份临床检验废弃的成人乙肝感染者淋巴细胞,抽提总RNA ,逆转录成cDNA,构建抗乙肝病毒人源免疫型Fab抗体文库.以HBsAg包板进行4轮循环的吸附-洗脱-扩增,挑单克隆用Phage-ELISA、DNA测序筛选阳性克隆,对阳性克隆进行可溶性表达,并用ELISA对其特异性进行鉴定.结果 构建的人源Fab型抗体文库的库容为2.0×108,并具有良好的多样性.经过4轮筛选,成功获得4株能与HBsAg结合的人源抗体克隆,分别命名为hFabHB1、hFabHB2、hFabHB3 和hFabHB4.对其中的hFabHB1进行可溶性表达,ELISA鉴定阳性.结论 成功构建了抗乙肝病毒人源免疫型Fa b抗体文库,从中筛选获得的4株人源Fab抗体片段有望在乙型肝炎的预防和治疗上发挥作用 .     

实验室感染SARS病例的血清学验证

本实验室作为安徽省选定的平行实验室于2004年4月20日接受了安徽省疾病预防控制中心送检的2份血清样品。同日我们对这2份样品进行了抗SAP6-CoV的抗体检测，简要报告如下。来源标示为1，2的2份血清样品收样后编号为2004-4-1、2004-4-2。我们按要求分别采用酶联免疫法和间接免疫荧光法检测了SARS-CoV抗体。     

江苏省2008年手足口病病原分析

肠道病毒71型(EV71)和柯萨奇病毒A16(CoxA16)为手足口病的主要病原体.江苏与山东、河南、安徽交界的区域是我国两大手足口病高发地区之一,本文对2008年4月上旬至6月中旬江苏12个市城乡63批次355份临床诊断为手足口病病人的咽拭子标本进行了病原分离,并对全部182个分离毒株进行鉴定,以了解江苏手足口病流行的病原特征.     

江苏省发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒的核酸检测及全基因组序列分析

目的 对江苏省2010年发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒(SFTSV)进行核酸检测并分析其全基因组序列.方法 用荧光定量PCR的方法对江苏省2010年SFTSV感染病例进行核酸检测,将所有阳性标本进行病毒分离,取8株代表性毒株测定其全基因组序列,序列结果用DNA Star和MEGA4软件进行分析.结果 33例发热伴血小板减少综合征疑似病例中,20例SFTSV核酸检测阳性.1例狗标本SFTSV检测也为阳性.8株SFTSV毒株全基因组序列与国内其他地区流行株的序列高度同源,其中M片段核苷酸序列同源性介于95.8％～98.7％之间,氨基酸序列同源性介于98.7％～99.7％之间;而与汉坦病毒属和白蛉热病毒属的相关序列相比差异较大,M段核苷酸序列同源性最高仅为27.1％,氨基酸序列同源性最高仅为7.3％.与一代病例密切接触后发病的二代病例序列与一代病例序列完全一致;狗携带的SFTSV序列与病人序列高度同源.结论 SFTSV江苏株与国内参考株序列无明显差异,与布尼亚病毒科的其他属序列差异巨大;SFTSV存在人传人的可能性;狗可能是SFTSV的传播宿主之一.     

纳米金比色芯片检测和鉴定病原微生物

目的：建立一种简单、快速的比色芯片判断PCR产物存在与否的方法。方法：在多重PCR过程中掺入生物素化的dUTP(biotin-16-dUTP)制备生物素化的靶序列，与相应的生物芯片杂交后，用链霉亲和素-纳米金结合银染的方法鉴定4种不同大肠杆菌血清型。同时，为了与链霉亲和素-藻红蛋白染色方法进行比较，用这两种方法检测了大肠杆菌血清型O157：H7的rfbE扩增产物。结果：纳米金比色芯片检测结果与琼脂糖凝胶电泳的结果一致，芯片杂交的纳米金标记与荧光标记检测的结果相当。结论：纳米金比色芯片能够对4种不同的大肠杆菌血清型进行准确鉴定，而且不需复杂的仪器，适合现场检测监控环境中的微生物。     

基于逆转录-环介导等温扩增技术快速检测发热伴血小板减少综合征病毒方法的建立

目的建立1种快速、特异、灵敏的发热伴血小板减少综合征病毒(SFTSV)的检测方法。方法针对SFTSV M基因保守区域的核酸序列,设计逆转录-环介导等温扩增(RT-LAMP)特异性引物,优化反应体系和条件。用毛细管电泳法和横向流动试纸条(LFD)法检测扩增产物,建立RT-LAMP检测方法。进行敏感性、特异性检验,并与Real-time RT-PCR法进行比较。结果以LFD法和毛细管电泳法检测RT-LAMP扩增产物具有相同的敏感性和特异性;RT-LAMP-LFD检测SFTSV的敏感性为10copies RNA分子/反应,且与其他病毒无交叉反应。RT-LAMP-LFD和Real-time RT-PCR检测临床标本阳性率差异无统计学意义(P0.05),2种方法一致性好(Kappa=0.918)。结论建立的RT-LAMP方法快速、简单、操作简单,具有较高的敏感性和特异性,适合应用于基层单位和现场SFTSV的快速检测。     

含肠道病毒71型VP1基因片段RNA病毒样颗粒的构建

[目的]构建含肠道病毒71型(EV71)VP1基因片段的抗核糖核酸酶的病毒样颗粒。[方法]利用PCR技术扩增大肠杆菌MS2噬菌体的外壳蛋白和成熟酶蛋白基因,将其克隆到pET32a中构建中间载体pET32a-MS2。将EV71VP1基因片段连接到中间载体噬菌体基因的下游,构建原核表达载体pET32a-MS2-EV71。将重组质粒pET32a-MS2-EV71转化宿主菌,经IPTG诱导表达获得病毒样颗粒,对病毒样颗粒进行透射电镜观察、RT-PCR检测和稳定性试验。[结果]重组质粒pET32a-MS2-EV71经PCR、双酶切鉴定和测序分析后证实构建成功;透射电镜观察到直径大约23nm的圆形病毒样颗粒;RT-PCR和稳定性试验结果表明,诱导产生的病毒样颗粒含EV71VP1基因片段,并且稳定性良好。[结论]成功构建了含EV71VP1基因片段的病毒样颗粒,稳定性良好,可作为病毒检测时标准品和质控品使用。     

一起急性呼吸道感染症暴发疫情的病原学和流行病学研究

目的：对一起急性呼吸道感染症暴发疫情进行流行病学和病原学研究，以明确诊断，控制疫情。方法：通过流行病学调查描述疫情流行特征；采用病例对照研究分析流行因素；患者的咽拭子标本中提取核酸；PCR法检测病毒特异性基因片段；组织培养法（Hep-2细胞）分离病毒；电子显微镜观察病毒形态；型特异血清及型特异引物鉴定分离毒株型别；中和实验检测患者急性期和恢复期血清抗体效价。结果：疫情报告病例871例，波及10个乡镇，主要为在校中小学及幼儿园学生（占94．37oA），具有班级聚集性。病例对照研究显示危险因素为与病人的接触、与鸡接触及家庭内共用毛巾等。35份咽拭子标本分离出15株病毒，分离阳性率42．9％。分离病毒经鉴定为腺病毒3型。PCR法检测腺病毒DNA，112份咽拭子标本中68份阳性，阳性率60．7％。18例双份血清中13例中和效价呈4倍以上增长或转阳，阳性率72．2％。对病毒进行全基因序列测定，确定为腺病毒3型。结论：本起急性呼吸道感染症暴发疫情由腺病毒3型引起，传播途径以呼吸道传播和密切接触为主。     

江苏省南通地区小肠结肠炎耶尔森菌分布特征初步研究

目的了解江苏省南通地区小肠结肠炎耶尔森菌的分布特点和毒力特征。方法用常规方法从家畜家禽粪便标本中分离小肠结肠炎耶尔森菌，PCR法检测其五种毒力相关基因，同时对国内分离到的O：8血清型菌株进行脉冲场凝胶电泳分析。结果从该地区293份家畜家禽粪便标本中分离到91株小肠结肠炎耶尔森菌，分离率为31．06％。未分离到国内主要流行血清型O：3和O：9，其中有39．57％菌株毒力基因分布特征为：ail^-、ystA^-、ystB^-、yadA^-、virF^-，有60．43％菌株为ail^-、ystA^-、ystB^＋、yadA^-、VirF^-，两株国外引进的强毒菌株具有相同的脉冲图形，与国内分离到的O：8血清型菌株存在显著的差异。结论致病性小肠结肠炎耶尔森菌的分布具有局限性，江苏省南通地区小肠结肠炎耶尔森菌的分布可能以非致病菌为主。