肝癌肝移植术后肿瘤复发相关蛋白的鉴定及生物信息学分析

目的 鉴定肝癌肝移植术后肿瘤复发相关蛋白并进行相关生物信息学分析.方法 取肝癌肝移植术后3年患者原发瘤标本,根据肿瘤复发情况,分为复发组(10例)和未复发组(10例).用双向电泳对两组总蛋白进行分离,质谱鉴定差异蛋白;用Gene Ontology和MetaCore软件进行生物信息学分析;用蛋白印迹法测定核纤层蛋白A/C(lamin A/C)的表达.结果 共鉴定出37个差异蛋白,相对于未复发组,复发组中表达上调2倍以上的蛋白16个,表达下调2倍以上的蛋白21个.按Gene Ontology进行分类发现它们主要分布于细胞浆(27％)和细胞器(24％);主要参与体内催化反应(38％)和结合反应(24％)等生物学功能.MetaCore数据库分析,发现多种蛋白参与细胞凋亡、细胞死亡、细胞发育过程的信号调控网络.我们应用蛋白免疫印迹对lamin A/C在两组间的差异表达情况进行了再验证,验证结果与质谱结果吻合.结论 肝癌肝移植术后转移复发与多种蛋白表达改变相关,lamin A/C可能为移植后肿瘤转移复发的潜在分子靶点.     

黏附分子CD44的表达及其糖基化与肝癌转移的相关性

目的 探讨CD44S及其变异体CD44v分子的表达和其糖基化与肝癌细胞侵袭转移的关系. 方法 用免疫组织化学法、量子点、RT-PCR、Western blot、细胞免疫荧光染色、甲基化特异性聚合酶链反应等技术检测转移与非转移性肝癌组织、不同转移潜能人肝癌细胞株中CD44S及其变异体CD44v的定位与表达;并应用多重凝集素印迹法检测这些细胞株中CD44v6的糖基化差异.组间均数比较应用方差分析及t检验,多组间等级资料的比较采用Wilcoxon秩和检验,各组间率的比较采用x2检验.结果 免疫组织化学结果显示,CD44S蛋白定位以细胞质为主; CD44v3、CD44v4/5蛋白定位于细胞膜与细胞质;而CD44v6主要定位于细胞膜.组织芯片结果显示,相对于CD44S及其他CD44v,CD44v6在转移组的表达水平高于非转移组(阳性率为75％与46％),差异具有统计学意义(x2=8.828,P＜0.05);量子点检测(t=2.392,P＜0.05)与血清学检测(t=2.56,P＜0.05)也证实这一结果.Western blot结果显示,CD44v6的表达与肝癌细胞转移潜能呈正相关.此外,在MHCC97L、MHCC97H肝癌细胞中CD44v6基因启动子发生不完全甲基化,而在Hep3B细胞中则发生完全甲基化.而且,相对于Hep3B细胞,MHCC97L及MHCC97H细胞中CD44v6蛋白对朝鲜槐凝集素、黑接骨木凝集素及麦胚凝激素的亲和力较高. 结论 在CD44S及其变异体CD44v中,CD44v6蛋白的高表达与肝癌转移潜能的增强呈正相关;其高表达可能与基因启动子低甲基化有关.此外,CD44v6蛋白唾液酸寡糖链的增加可能与肝癌细胞转移潜能增高有关.     

二乙基亚硝胺诱发大鼠肝癌过程中癌前病变阶段差异表达蛋白质的筛选

目的 通过比较二乙基亚硝胺(DEN)诱发大鼠肝细胞癌发生过程中不同阶段的蛋白质表达谱,筛选在大鼠肝癌前病变阶段起重要作用的蛋白质分子. 方法大鼠分为DEN组和正常对照组,诱癌过程中定期处死动物并取其肝组织;以γ-谷氨酰转肽酶染色阳性的肝细胞增生灶为标志,识别和获取肝癌前病变的组织标本.用双向电泳及基质辅助激光解吸飞行时间串联质谱法对大鼠正常肝组织、癌前病变组织和肝癌组织的全蛋白质组表达谱进行比较和鉴定.用Western blot和RT-PCR方法对部分差异表达蛋白质(如层黏连蛋白受体1和鲱精胺酶)进行表达水平的验证.结果 筛选出表达水平差异≥2倍的蛋白质共82种,其中在癌前病变阶段即发生明显改变的差异表达蛋白质有47种,包括在正常对照组、癌前病变组、肝癌组呈现依次上调的层黏连蛋白受体1等8种蛋白质和在上述组织中呈现依次下调的鲱精胺酶等22种蛋白质.Western blot和RT-PCR方法对层黏连蛋白受体1和鲱精胺酶表达水平的验证结果与双向电泳的结果相似.结论 大鼠肝癌形成过程中不同阶段的蛋白质表达谱有所不同,对癌前病变的差异表达蛋白质如层黏连蛋白受体1和鲱精胺酶等进行深入探讨,有望为人类肝癌的早期诊断和治疗提供线索.     

肝癌发生不同病理阶段血清蛋白质组的比较

目的 比较肝癌发生不同病理阶段血清蛋白质组的表达变化情况,从中寻找特异性标志物.方法 用双向凝胶电泳分离正常人,慢性肝炎、肝硬化和肝癌患者的血清蛋白质,结合质谱技术对差异点进行鉴定; Western blot检测结合珠蛋白β链以验证蛋白质水平的表达.计量资料数据以均数±标准差(x±s)表示,采用方差分析和LSD检验进行两两比较.结果 4组血清的双向电泳图谱经软件匹配分析,并与基质辅助激光解析电离飞行时间质谱相结合,成功鉴定出结合珠蛋白,SAA1、SP40等30个差异蛋白质点,K cluster聚类分析不同的变化模式.在差异蛋白质点中,7个蛋白质点均为结合珠蛋白,呈现由正常→肝炎→肝硬化持续下调、到肝癌又上调的模式.Western blot证实结合珠蛋白β链的表达与双向电泳表达相一致.结论 在肝癌发生的动态过程中各疾病阶段的血清蛋白质差异表达有4种明显变化模式,可能为肝癌的早期诊断和预后提供依据,与肝癌发生发展相关的结合珠蛋白很可能是肝硬化发展到肝癌的一个潜在早期诊断标志物.     

SELDI—TOF—MS技术建立早期肝硬化患者血清蛋白质谱筛选模型

目的：比较早期肝硬化患者和健康人的血清蛋白质谱并建立相关血清诊断模型。方法：用表面增强激光解吸电离-飞行时间质谱（SELDI-TOF—MS）技术及CM10蛋白芯片对50例早期肝硬化患者、50例健康人血清样本进行分析,将获得的血清蛋白质指纹图谱,用计算机软件进行比较分析。结果：早期肝硬化患者与健康人对照组共有25个差异有统计学意义的蛋白质峰;建立诊断模型的灵敏度为96％（48／50）,特异度为90％（45／50）,准确率为93％（93／100）。结论：两组人的蛋白质谱有明显的差异,建立的诊断模型能够区分早期肝硬化患者与健康人,SELDI—TOF—MS技术在诊断及特异性蛋白质生物标志分子的筛选等方面具有较好的临床应用价值。     

肝细胞肝癌中的N-糖基化相关的糖基转移酶的研究进展

肝细胞肝癌（hepatocellular carcinoma,HCC）是常见的恶性肿瘤之一,全球每年超过50万人确诊为HCC.我国HCC病死率占全球HCC病死率的50％,转移和复发是导致其高病死率的主要原因[2].HCC的诱发涉及多种因素,主要有肝炎病毒的感染、黄曲霉毒素的摄入、饮水中蓝藻毒素污染以及吸烟、酗酒等.随着研究的不断深入,人们发现,HCC的发生、转移等过程常伴随有HCC细胞表面糖蛋白的异常糖基化.异常糖基化是由一种或多种糖基转移酶（glycosyltransferase,GT）表达水平或活性改变引起的.对GT的研究可以为HCC的临床诊断以及抗HCC药物作用靶点的设计提供理论依据.     

稳定表达stathmin Ser25磷酸化位点突变的肝癌细胞株的建立

目的：建立稳定表达stathmin Ser25磷酸化位点点突变（stathmin S25A）的肝癌细胞株。方法：采用PCR定点突变的方法构建stathmin S25A的重组质粒,并用酶切和测序技术鉴定突变结果;采用脂质体转染的方法,筛选建立stathmin野生型（wt）和突变型（S25A）的肝癌细胞HCCLM6,用Western blotting进行鉴定。结果：定点突变构建stathmin S25A的重组质粒,测序证实stathmin 25位丝氨酸突变为丙氨酸。将stathmin wt和S25A转染HCCLM6,筛选建立稳定表达的肝癌细胞株,Westernblotting检测发现stathmin pS25在stathmin S25A细胞中的表达较stathmin wt和对照组细胞明显下降（P〈0.05）。结论：建立了稳定表达stathmin S25A的肝癌细胞株,为研究stathmin位点磷酸化在肝癌发病中的分子机制提供实验模型。     

E-选择素在胚胎着床过程中小鼠子宫内膜的表达规律

目的：研究E-selectin在胚胎着床及早期分化中的作用。方法：用RT—PCR、Immunoblot、Western blot法检测小鼠胚胎着床前后蜕膜组织E-selectin的表达。结果：E-选择素在孕4天的小鼠子宫内膜中的表达出现升高，第5天达到峰值，随后妊娠第6、第7天E-selectin蛋白的表达则逐渐下降至正常水平。结论：提示E-选择素可能参与了胚胎着床过程。     

细胞因子对白血病抑制因子在小鼠孕早期子宫内膜表达的调节

本研究观察了白细胞介素 - 1(IL - 1)、白细胞介素 - 6 (IL - 6 )、单、粒 -细胞集落刺激因子 (GM- CSF)对子宫内膜白血病抑制因子 (LIF)表达的调节 ,探讨围着床期 LIF表达的调节机制。给妊娠 2～ 4 d的小鼠分别腹腔注射不同剂量的 IL - 1、白介素 - 1受体拮抗剂 (IL- 1ra)、IL- 6、GM- CSF,对照组注射 PBS,用免疫印迹法逆转录 -聚合酶链反应进行子宫内膜 LIF蛋白和 m RNA的半定量分析。结果 :对照组 LIF蛋白水平为 39.6 4± 9.95,与对照组比 ,IL - 14μg/kg剂量组明显升高 (P<0 .0 1) ;IL- 6和 GM- CSF 0 .8和 4μg/kg剂量组均明显升高 (分别为 P<0 .0 5,P<0 .0 1)。对照组 L IFm RNA水平为 1.10± 0 .2 1、IL-1、IL- 6和 GM- CSF4 μg/kg剂量组明显高于对照组 (分别为 P<0 .0 5,P<0 .0 5,P<0 .0 1) ,IL - 1ra 2 0μg/kg剂量组与对照组相比明显下降 (P<0 .0 5)。表明 IL- 1、IL - 6、GM-CSF对孕早期小鼠子宫内膜 LIF转录和转录后水平均有上调作用 ,可能是 L IF在围着床期子宫内膜的规律表达的潜在正调节因子     

原发性肝细胞癌β-catenin基因突变的研究

β 连环蛋白 ( β ｃａｔｅｎｉｎ)不但在钙粘蛋白 (ｃａｄｈｅｒｉｎ)介导的细胞粘附 ,而且在细胞发育、分化、细胞骨架维持上起重要作用。β ｃａｔｅｎｉｎ基因突变所致 β ｃａｔｅｎｉｎ蛋白异常与结肠癌、黑色素瘤等发生关系密切 ,被认为是候选的癌基因之一〔1〕。有关 β ｃａｔｅｎｉｎ基因在肝癌中突变情况国外报道极少 ,国内尚未见报道。本文研究了上海医科大学肝癌研究所手术切除的 3 4例肝癌标本中 β ｃａｔｅｎｉｎ基因突变 ,现报告如下。1.资料和方法 :( 1)收集上海医科大学中山医院肝癌研究所 1999年 2～ 7月间手术切除的经…