共表达人B7-1和HGF/NK4基因的重组腺病毒的制备及初步鉴定

目的 构建能同时表达B7-1和HGF/NK4基因的重组腺病毒载体,同时制备相应的复制缺陷型重组腺病毒,检测其在喉癌细胞中的表达.方法 构建以串联方式携带人B7.1和HGF/NK4基凶的重组穿梭载体pAdtrack-NK4-B7-1.Pme I线性化后与腺病毒载体pAdEasy-1共转化大肠杆菌BJ5183,通过同源重组得到重组腺病毒载体pAd-NK4-B7-1.将重组腺病毒载体转染HEK293包装细胞制备重组腺病毒,应用病毒悬液感染人喉癌细胞株.用RT-PCR检测感染细胞中B7.1和NK4基因mRNA表达.结果 酶切鉴定证实阳性pAdTrack-NK4-B7-1重组穿梭载体含有目的基因B7-1和HGF/NK4,同源重组后制备的病毒载体DNA经酶切鉴定获得了阳性重组腺病毒载体,该载体能有效转染HEK293细胞并在细胞内成功包装,转染3 d后可以观察到绿色荧光蛋白(GFP)表达并逐渐增多、增强.制备的Ad-NK4-B7在体外能有效感染Hep-2细胞,感染后可维持6 d高水平的B7-1和NK4基因的表达,整体表达可持续2周.结论 成功构建了同时表达B7-1和NK4基因的重组腺病毒载体并制备出重组腺病毒颗粒,该病毒能有效地感染喉癌细胞并表达高水平的NK4和B7-1基因,为进一步研究B7-1和NK4基凶的功能及应用B7-1和NK4进行喉癌的联合基因治疗提供了依据和素材.     

人转化铁受体基因的克隆和表达

目的探讨人转化铁受体基因（hTfR）克隆和高效表达的方法及临床意义。方法用RT-PCR法从人胚肝、肺组织中克隆hTfR基因，构建重组表达质粒pcDNA3-hTfR和pEGFP-C1-hTfR，转染人胚肾上皮HEK293细胞。用Western印迹法检测pcDNA3-hTfR转染HEK293细胞后hTfR蛋白的表达情况；用荧光显微镜和共聚焦荧光显微镜观察重组pEGFP-C1-hTfR质粒转染HEK293细胞后hTfR蛋白的表达水平及亚细胞定位。结果经过DNA测序证实，克隆的hTfR基因为全长cDNA序列（2332bp）。Western印迹法检测到转染细胞能有效表达190×10^3的hTfR蛋白，荧光显微镜和共聚焦荧光显微镜观察到绿色荧光蛋白（GFP）-hTfR融合蛋白主要定位于细胞膜。结论从人胚肝、肺组织中可以成功克隆hTfR基因，该基因转染HEK293细胞后可获得hTfR蛋白的高效表达。hTfR主要定位于细胞膜。     

血管内皮生长因子与烟雾暴露所致大鼠肺气肿发病关系的研究

目的　探讨血管内皮生长因子 (VEGF)与烟雾暴露所致大鼠肺气肿发病的关系。方法3 6只 12周龄雌性SD大鼠随机均分为烟雾暴露组 (S组 )和正常对照组 (N组 )。S组随机均分为S1、S2 、S3 组 ,分别烟雾暴露 2、4、8周 ;N组亦随机均分为N1、N2 、N3 组 ,在常氧下再饲养 0、4、8周。分别用逆转录 聚合酶链反应 (RT PCR)和改良的链霉亲合素 生物素 过氧化物酶复合物 (SABC)法检测大鼠肺内VEGFmRNA、VEGF及其受体 2 (KDR ,激酶插入区包含受体 )蛋白表达水平 ;苏木精 伊红 (HE)染色评估S组大鼠肺部病理改变 ,用平均内衬间隔 (MLI)与平均肺泡数 (MAN)评估肺气肿程度。用SPSS10 0进行方差分析、非参数检验和相关性分析。结果　 (1)S组大鼠出现肺部炎症 ,至第 8周 (即S3组 )出现早期肺气肿样改变 ,S3 组的MAN较同时段N3 组显著下降 ,MLI显著增加 (P <0 0 5) ;(2 )S组大鼠肺组织VEGF表达及肺血管内皮细胞KDR表达显著下降 :S1组与N1组比较 ,VEGF189mRNA及肺泡、支气管上皮VEGF蛋白表达下降 (P <0 0 1) ;S2 组与N2 组比较 ,VEGF189、VEGF165、VEGF12 1mRNA及肺泡、支气管上皮VEGF蛋白表达均显著降低 (P <0 0 1) ;S3 组VEGFmRNA表达与N3 组比较差异无显著性 (P >0 0 5) ,但肺泡、支气管上皮细胞VEGF蛋白质表达及     

老年长期下呼吸道感染患者肺泡灌洗液中溶菌酶检测的意义

本文用溶菌板分析法测定了老年人长期下呼吸道感染者肺泡灌洗液(BALF)中溶菌酶(Lym)的水平,发现长期下呼吸道感染的老年人BALF中的Lym明显低于非下呼吸道感染的老年人(P<0.05);同时显示老年非下呼吸道感染者明显低于中青年对照组(P<0.025),中青年下呼吸道感染者明显高于非下呼吸道感染的同龄人(P<0.01)。说明老年人细胞免疫功能显著降低,长期肺部感染时更加重了细胞免疫功能的损害。这可能是老年人易感染、不易治愈和反复发作的原因之一。测定长期下呼吸道感染的老年患者BALF中的Lym有助于判断患者的免疫状况,对疾病的治疗及预后有一定的指导意义。     

我国7省市城区40岁及以上居民支气管扩张症的患病情况及危险因素调查

 目的 了解我国7省市城区支气管扩张症的患病状况及危险因素。方法 本研究为横断面调查。采用多阶段整群随机抽样方法,在北京市、上海市、广东省、辽宁省、天津市、重庆市和陕西省各抽取一个城市街道作为调查点,对≥40岁的人群进行问卷调查和肺功能检测,询问既往是否被医生诊断过支气管扩张症、是否有呼吸症状及可能的危险因素等。结果 全国7省市城区共抽样≥40岁的居民14 337人,完成有效调查10 811人,调查应答率为75.4%。1.2%（135/10 811）的≥40岁居民曾诊断患有支气管扩张症,其中男性为1.5%（65/4382）,女性为1.1%（70/6429）,男女间差异无统计学意义（P=0.070）;支气管扩张症患病随年龄增加而增多;各地区间支气管患病情况差异无统计学意义（P=0.103）,经多因素logistic逐步回归分析校正混杂因素后,各地区间的支气管扩张症的患病情况差异有统计学意义（Wald值为22.116,P=0.001）;多因素logistic逐步回归分析还显示,年龄越大、有呼吸疾病家族史、有儿童时期呼吸道感染史、燃煤暴露、既往患慢性咽炎、肺结核、心脏病和肺癌与支气管扩张症相关;儿童时期感染≥2种呼吸道疾病的人群、家族中≥2人患呼吸疾病的人群患支气管扩张症的相对危险度增加。结论 我国城区≥40岁人群支气管扩张症患病多,其患病与年龄、有呼吸疾病家族史、有儿童时期呼吸道感染史、燃煤暴露、既往患慢性咽炎、肺结核、心脏病和肺癌等因素有关。     

广州城市慢性阻塞性肺疾病住院患者的疾病认知行为状况调查

目的：了解患者对慢性阻塞性肺疾病（COPD）的认知行为状况,为进一步的认知行为干预（如卫生宣教和康复锻炼）提供依据。方法：采用系统抽样方法,选取广州医学院第一附属医院2008年1月-2008年12月住院的住院号尾数为双数住院的COPD患者共209例,对其进行有关COPD认知行为的横断面调查。入选的患者采用自制的认知行为问卷进行调查。结果：200例患者完成认知行为问卷调查其调查率为95．7％（200／209）①其中,男性180人（90,0％）,女性20人（10．0％）;平均年龄为（68．8±9．5）岁,Ⅲ、Ⅳ级COPD患者分别占31．5％（63／200）和45．5％（91／200）。②患者对COPD的认知仍然相当贫乏。仅有127（63．5％）人听说过COPD;43．2％（86／199）的患者不了解急性加急慢阻塞解性AECOPD;10．5％不知道COPD有哪些症状;22．0％不知道COPD的危险因素;23．5％的患者不知道吸烟是COPD的危险因素;超过80％的患者不知道生物燃料和职业接触与COPD有关。⑧患者并没有采取对COPD积极的、有益的行为模式,仍有13．7％（27／197）的COPD患者现吸烟,仅63．0％（126／200）的患者遵医嘱服药;7．5％（15／200）的患者参加过COPD防治知识讲座;仅26．5％（53／200）的患者被告知治疗药物的作用;只有21．0％（42／200）的患者进行过肺康复治疗。结论：广州市三甲医院住院的中、重度COPD患者对COPD的认知行为仍然较差,亟待加强。     

分次胶原酶消化法分离、培养成人肺微小动脉平滑肌细胞

目的：建立一种简便、高效分离和培养成人肺微小动脉平滑肌细胞的方法并鉴定该方法培养的传代细胞生物学特性。方法：分次胶原酶消化法与传统胶原酶消化法进行细胞获得率、细胞存活率及培养成功率比较;绘制生长曲线对原代与传代细胞的生长特性进行分析;细胞形态学观察、平滑肌肌动蛋白（SMα-actin）测定及细胞免疫荧光化学法进行细胞鉴定及纯度计算;比较原代与第10代细胞形态、SMα-actin含量、染色体数量及形态。结果：分次胶原酶消化法优于传统胶原酶消化法,细胞获得率（3.10±0.29 vs 1.20±0.35）×108 cells/L、细胞存活率(69% vs 21%)及培养成功率（61.5% vs 16.7%）（P＜0.01);传代细胞长至融合时间7 d快于原代细胞21 d;细胞显典型的“峰-谷”状生长,胞浆内表达SMα-actin,细胞纯度达98%以上;原代与第10代细胞形态、SMα-actin含量、二倍体数量（78.13% vs 76.47%）及形态无明显差别（P＞0.05）。结论：分次胶原酶消化法是一种简便、可行,获得高纯度、功能良好的成人肺微小动脉平滑肌细胞的方法。经过此方法分离、培养的细胞在10代以内传代培养细胞生物学及遗传学特性稳定,可用于实验。     

中国七省市慢性阻塞性肺疾病患者的生命质量现况调查

目的 评估COPD患者的牛命质量及其影响因素.方法 2002-2004年对北京、上海、广东、辽宁、天津、重庆和陕西等7个地区城乡40岁及以上人群进行COPD横断面调查,对入选的20245人进行问卷调查和肺功能检测,采用12个条目的 简短生命质量量表(SF-12)评估生命质量,支气管舒张试验后FEV1/FVC＜70%者诊断为COPD.SF-12评分经秩转换后采用一般线性模型分析比较各组间的差别.采用多因素逐步线性同归分析方法 分析影响生命质量的因素.结果 与非COPD患者相比,COPD患者的生命质量下降,心理成分评分分别为(56±7)分和(57±6)分,躯体成分评分分别为(46±9)分和(50±6)分,差异均有统计学意义(F值分别为4.442和453.960,P＜0.05和P＜0.01).COPD患者的心理成分评分主要受气促严重程度、体重指数、合并疾病、性别和居住在城乡的影响;COPD患者的躯体成分评分主要受气促严重程度、合并疾病、性别、COPD分级、职业粉尘烟雾暴露史、年龄、文化程度和既往诊断COPD的影响.结论 COPD患者的生命质量下降,并与气促和疾病严重程度、体重指数和合并疾病密切相关.改善气促症状,加强营养支持,减少合并疾病,远离危险因素的暴露可以改善COPD患者的生命质量.     

腺病毒潜伏感染加重生物燃料烟雾所致的豚鼠肺部及血清中氧化-抗氧化失衡

目的 探讨腺病毒潜伏感染在生物燃料烟雾所致的豚鼠肺部及血清中氧化-抗氧化失衡中的作用.方法 将46只白化豚鼠用随机数字表法分为感染组(26只)和假感染组(20只),感染组鼻腔接种野生型腺病毒5型,假感染组接种PBS作为对照.22 d后随机将各组剩余动物(各20只)再各分为暴露于木材锯末和谷壳烟雾组和暴露于新鲜空气的对照组.暴露结束后进行肺组织病理检测,并检测肺组织匀浆及豚鼠血清中的谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)、还原型谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、总抗氧化能力及BALF中的MDA、SOD、总抗氧化能力.所有数据均以(x)±s表示,采用SPSS 15.0软件进行析因方差分析,组间比较采用单因素方差分析,P＜0.05为差异有统计学意义.结果 腺病毒潜伏感染使豚鼠肺组织匀浆及血清中GSH-PX、GSH、SOD、总抗氧化能力显著降低(F值分别为171.024、109.05、24.704、41.660、23.513、12.652、12.447、14.912,P值均＜0.01),使豚鼠肺组织匀浆CAT降低(F=5.081,P＜0.05),MDA升高(F=5.725,P＜0.05).生物燃料烟雾暴露使豚鼠肺组织匀浆及血清中GSH-PX、GSH、SOD、CAT、总抗氧化能力显著降低(F值分别为316.979、430.92、36.462、164.64、175.621、109.86、271.558、16.710、94.802、56.668,P值均＜0.01),MDA显著升高(F值分别为56.083、32.928,P值均＜0.01).腺病毒感染和生物燃料烟雾暴露的交互效应使豚鼠肺组织匀浆GSH-PX降低(F=4.384,P＜0.05)及血清中GSH-PX、GSH降低(F =13.233,P＜0.01;F=5.979,P＜0.05),腺病毒感染+生物燃料烟雾暴露组与单纯生物燃料烟雾暴露组比较,豚鼠肺组织匀浆中GSH、SOD、CAT、总抗氧化能力降低(F值分别为19.690、17.177、14.630、16.070,P值均＜0.01),血清中SOD及总抗氧化能力降低(F值分别为15.664、12.975,P值均＜0.01).结论 木材锯末与谷壳烟雾可导致豚鼠肺部氧化-抗氧化失衡,腺病毒潜伏感染加重了由生物燃料烟雾引起的豚鼠肺组织氧化-抗氧化失衡.     

人NP9基因蛋白重组腺病毒的制备

目的：制备表达人NP9蛋白的复制缺陷型重组腺病毒。方法：酶切pMD18T-NP9质粒获得NP9基因编码区序列并克隆至芽梭载体构建重组pAcTrack-CMV-NP9载体，线性化后与pAdEasy-1共转化BJ5183，通过同源重组得到重组的pAD-NP9病毒载体将重组腺病毒载体转染HEK293包装细胞制备重组腺病毒。结果：酶切鉴定得到阳性pAD-NP9重组腺病毒载体，该载体能有效转染HEK293细胞并在细胞内成功包装，转染3d后可以观察到绿色荧光蛋白(CFP)表达并逐渐增多、增强：结论：成功构建了NP9基因的重组腺病毒载体并制备重组腺病毒颗粒，为进一步研究NP9基因的功能及应用NP9进行基因治疗奠定基础。