肺癌基因治疗

肺癌基因治疗冉丕鑫，李岱宗，陈顺存，钟南山一、肺癌治疗现状近年来，肺癌的发病率和死亡率逐渐上升，在我国沿海城市，肺癌在男性中已占常见肿瘤的首位，女性中居第２或第３位。尽管人们花了很大精力去探究防治肺癌的方法，效果仍不理想，如非小细胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）...     

hBcl-2和hVEGF165双基因共表达重组腺病毒载体的构建及鉴定

目的构建hBcl-2和hVEGF165双基因共表达的重组腺病毒载体,为后续基因转染和动物实验提供实验基础。方法通过RT-PCR从A549细胞中分别获得hBcl-2和hVEGF165基因片段,并克隆到pMD-19T载体。将目的基因hBcl-2、IRES元件和hVEGF165依次定向克隆到腺病毒穿梭载体质粒pAd-Track-CMV上。线性化重组穿梭质粒后通过电穿孔转化含有腺病毒骨架质粒pAd-easy-1的感受态大肠杆菌BJ5183构建重组腺病毒载体质粒。脂质体转染线性化的重组腺病毒载体质粒于HEK293细胞以包装制备重组腺病毒。重组腺病毒经PCR鉴定之后进一步扩增、纯化。通过荧光计数确定病毒感染滴度。结果克隆的hBcl-2和hVEGF165基因测序正确,酶切重组穿梭载体质粒和腺病毒载体质粒得到特异酶切产物,重组腺病毒载体质粒转染HEK293细胞3 d后观察到GFP的表达,重组腺病毒的PCR得到hBcl-2和hVEGF165基因的PCR产物,滴度测定为5×109pfu/mL。结论成功构建制备了高滴度的hBcl-2和hVEGF165双基因共表达的重组腺病毒载体,为联合基因治疗心肌梗死的研究提供实验基础。     

喉癌来源的MAGE-A3基因真核表达载体及其稳定表达模型的构建和鉴定

目的：克隆人黑色素瘤相关抗原MAGE—A3基因,构建真核表达载体,检测、鉴定其在细胞中的表达。方法：MAGE-A3基因进行PCR扩增,凝胶回收PCR产物片段并连接至pMDl8一T载体。测序后将MAGE—A3基因片段亚克隆至真核表达载体,构建成plRES2-EGFP／MAGE—A3重组质粒。经脂质体转染至293T细胞株后,荧光定量PCR、Western-blotting法鉴定MAGE—A3基因的表达。结果：MAGE-A3基因正确克隆在plRES2-EGFP／MAGE-A3,测序结果与GenBank公布的MAGE—A3序列一致。转染293T细胞后能检测到MAGE-A3基因和蛋白的表达。结论：成功构建plRES2-EGFP／MAGE—A3真核表达质粒,并能在293T细胞中有效表达MAGE—A3蛋白,奠定了其作为DNA疫苗应用的基础。     

广州社区慢性阻塞性肺疾病认知行为调查研究

目的了解社区人群对慢性阻塞性肺疾病(COPD)的认知行为情况,为制定COPD干预措施提供依据。方法采取多级抽样的策略,在广州荔湾区简单随机抽取2个街道,在每个街道再简单随机抽取2个社区,在每个社区再采用简单随机方法,抽取700例40岁及以上居民,进行COPD认知行为的横断面调查。入选的人群采用经过信度和效度检验的自制的认知行为问卷调查进行调查。结果抽查的700人中,630例(90.0%)完成认知行为调查问卷,只有46.3%(292/630)人听说过COPD,42.2%(266/630)不知晓慢性支气管炎和肺气肿的危险因素。人群吸烟率为40%(252/630),男性吸烟率为75.5%(209/277),女性吸烟率为12.2%(43/353);其中现吸烟率为26.3%(166/630),仅35.0%(59/166)的现吸烟者准备戒烟。46.0%(290/630)人长期有被动吸烟史。人群中仍有22.4%(141/630)不知道吸烟的危害,14.8%(93/630)的人觉得可以在公共场所吸烟。结论广大民众COPD防治知识贫乏,防治意识差,需要加强COPD宣传教育和防治。     

大蒜素对大鼠肺泡上皮细胞γ谷氨酰半胱氨酸合成酶表达的影响

目的观察大鼠肺泡上皮细胞(CCL149细胞系)谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)及γ谷氨酰半胱氨酸合成酶(γGCS)等表达变化,了解大蒜素对CCL149细胞抗氧化能力的影响。方法在以四甲基偶氮唑盐(MTT)法确定大蒜素适当作用浓度的基础上,用不同浓度大蒜素(0、0.1、1.0、5.0μg/ml)作用CCL149不同时间(6、12、24、48h),用分光光度法检测细胞内GSH、MDA的变化;用Westernblot法检测细胞内γGCS蛋白的表达,分析不同处理剂量、不同处理时间大蒜素对细胞内GSH、MDA及γGCS的影响。结果(1)大蒜素浓度≤5μg/ml不影响细胞活力。(2)大蒜素0.1、1.0、5.0μg/ml组在处理6h后细胞内GSH含量[6h组GSH含量分别为(16.45±0.69)、(16.81±0.79)、(17.80±1.10)mg/g蛋白]较对照组[(13.38±1.16)mg/g蛋白]显著增加(t=3.92～4.78,P均<0.05),MDA含量[(1.07±0.02)、(1.02±0.06)、(1.00±0.05)nmol/mg蛋白]较对照组[(1.23±0.05)nmol/mg蛋白]下降(t=5.75～6.34,P均<0.05)。细胞内GSH水平升高至24h达顶峰,48h有所下降,仍较对照组高,相同时间点不同大蒜素浓度组分别与对照组比较,差异均有统计学意义(P均<0.05)。(3)大蒜素0.1、1.0、5.0μg/ml组在刺激6、12、24h细胞内γGCS蛋白表达(24h为0.693±0.027、0.646±0.081、0.667±0.077)较对照组(0.531±0.007)显著增强(t=2.82～9.92,P<0.05),各观察指标未呈现剂量依赖性。结论大蒜素能增强大鼠肺泡上皮细胞的抗氧化作用,可能与其促进γGCS的表达有关。     

产超广谱β-内酰胺酶肺炎克雷伯菌分子流行病学研究进展

产超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)是导致肺炎克雷伯菌耐药的主要原因。现对其基因分型、检测方法及产超广谱β-内酰胺酶肺炎克雷伯菌分子流行病学研究作一综述。     

血管内皮生长因子及其受体KDR在成熟期大鼠肺内的表达

目的:观察血管内皮生长因子(VEGF)及其受体KDR在成熟期正常SD大鼠肺内的表达情况。方法:取18只成熟期SD大鼠,用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和改良的SABC免疫组化法检测其肺内VEGFmRNA、VEGF蛋白及其受体2(KDR,激酶插入区包含受体)表达水平。结果:12周龄大鼠肺内有一定量VEGFmRNA(VEGF189 2.13±0.81;VEGF165 0.69±0.22;VEGF121 0.60±0.30)和KDR表达;16周大鼠肺部VEGF mRNA表达较12周龄鼠有所增加,但差异无显著性。20周龄大鼠肺部VEGF165与VEGF120 mRNA与16周龄对比均明显减少(P<0.05;P<0.01),肺泡上皮及支气管上皮细胞VEGF蛋白表达水平亦较16周龄大鼠显著降低(P<0.01;P<0.01)。结论:VEGF对大鼠肺的生长发育和维持其正常生理功能可能具有一定意义。     

肝细胞生长因子对心肌细胞肥大的影响

目的 探讨肝细胞生长因子（HGF）在培养新生大鼠心肌细胞肥大中的作用。方法 原代心肌细胞中进行，分对照组和不同浓度HGF组（1ng／mL、10ng／mL、100ng／mL），采用放射性同位素3H-leu掺入法检测培养心肌细胞蛋白质合成速率。应用荧光定量PCR方法检测HGF对培养心肌细胞肥大相关基因ANF、B-MHC表达的影响。结果 HGF（1ng／mL、10ng／mL、100ng／mL）作用心肌细胞24h后可明显增加心肌细胞3H—leu的掺入量，分别增高2．15、4．66、2．51倍，与对照组比较有显著性差异（P〈0．01，0．01，0．01）；并可诱导心肌细胞ANF和B-MHC表达增加，ANFmRNA表达增加平均为（2．63±0．04，4．32±0．08，3．91±0．05），分别增高1．61、3．32、2．91倍，与对照组（1±0．00）比较有显著性差异（P〈0．01，0．01，0．01）；B-MHCmRNA表达增加平均为（2．14±0．03，2．81±0．07，2．42±0．06），分别增高1．10、1．82、1．41倍，与对照组比较有显著性差异（P〈0．01，0．01，0．01）；上述结果表明1ng／mL已经起作用，10ng／mL作用最强，100ng／mLHGF有所下降。结论 肝细胞生长因子可促进心肌细胞蛋白质合成速率和心肌细胞ANF、B-MHC表达增加，它可直接促进心肌细胞的肥大。     

人内皮型一氧化氮合酶重组腺病毒在小鼠肺内表达

一氧化氮合酶（NOS）是合成一氧化氮（NO）的关键酶，主要包括3个亚型：神经型（nNOS）、诱导型（iNOS）、内皮型（eNOS）。eNOS主要分布于血管内皮，通过催化NO的生成而在调节血管壁张力及维持血管壁构型方面发挥重要作用。各种引起内皮功能受损的原因均可使NOS生成减少，导致NO生成不足，破坏体内内皮素1／一氧化氮（ET-1／NO）的平衡。本研究从人脐静脉血管内皮成功克隆出人eNOS（heNOS）eDNA全长基因的基础上，构建了复制能力缺陷型heNOS重组腺病毒转移载体，并对其功能和转移途径进行初步研究，旨在探讨从基因角度补充NOS以维持体内ET-1／NO平衡，治疗因NO不足而导致的血管损伤性疾病的可能性。     

缺氧对大鼠肺组织成纤维细胞生长因子和C-myc癌基因表达的影响

目的为探讨成纤维细胞生长因子（ＦＧＦ－ｂ）和Ｃ－ｍｙｃ基因在缺氧性肺动脉重建中的作用。方法采用免疫组化和原位分子杂交方法，对不同缺氧时期大鼠肺组织中ＦＧＦ－ｂ的表达及癌基因Ｃ－ｍｙｃ信使核糖核酸（ｍＲＮＡ）转录水平进行了观察。结果缺氧１４天时肺动脉平滑肌及外膜间质的ＦＧＦ－ｂ明显增多，而Ｃ－ｍｙｃｍＲＮＡ在缺氧７～２１天组大鼠肺组织中有过量表达。结论（１）缺氧可激活Ｃ－ｍｙｃ癌基因以及增强ＦＧＦ－ｂ的表达；（２）ＦＧＦ－ｂ和Ｃ－ｍｙｃ癌基因参与了慢性缺氧所致肺动脉壁的改建过程。