肝癌高低发区肝病对比调查

近几年来,国内外对肝炎与肝癌的关系甚为重视。我们自1964年以来即注意此问题,曾在一些肝癌高发和相对底发区进行肝病(包括肝炎、肝硬化、肝癌)对比调查,由于各次检测项目及方法的不同,结果亦不大一致。1979年6～9月我们利用乙型肝炎表面抗原较灵敏的检测方法,同时增加了检测项目,如乙型肝炎表面抗体、肝功能试验、Ig 等,对扶绥县肝癌高发区与桂北地区相对低发区再次进行对比调查研究,进一步探索肝癌的病因。     

人轮状病毒抗原非复制型重组腺病毒黏膜免疫效果的研究

目的：对人轮状病毒抗原非复制型重组腺病毒诱导黏膜免疫的效果进行初步评价。方法：用表达轮状病毒VP7、VP6基因的3株重组腺病毒rvAdG1VP7(G)、rvAdG1VF7和rvAdVP6，分别通过灌胃和滴鼻两种途径对BALB／C小鼠进行2次免疫后，对肺灌洗液和肺、肠粘膜组织匀浆液中轮状病毒特异性的分泌型IgA(secretory IgA，SIgA)和local-IgG进行检测。结果：对肺灌洗液中特异性SIgA进行检测，发现滴鼻组的免疫学效果明显优于灌胃组。对肺、肠组织匀浆液中特异性IgA的分析表明，灌胃途径刺激异位粘膜组织产生免疫应答的能力较弱。对rvAdVP6滴鼻组小鼠肺灌洗液(1：20)特异性local-IgG和SIgA的阳转率进行比较，发现特异性local-IgG的应答水平明显高于特异性SIgA。结论：重组腺病毒可有效诱导针对轮状病毒的黏膜免疫。此研究为轮状病毒基因工程疫苗的免疫方案、免疫途径及免疫保护作用等的进一步研究莫定了基础。     

重度烟雾吸入致大鼠急性肺损伤的免疫应答及其机制探讨

目的分析重度烟雾吸入致吸人性急性肺损伤(ALI)对大鼠肺自然免疫及特异性免疫反应。方法分别复制一氧化碳(CO)浓度为2×10~(-3)(低浓度)和4×10~(-3)(高浓度)重度烟雾吸入致大鼠吸人性ALI模型。观察染毒后0～24 h大鼠肺组织病理学变化;检测支气管肺泡灌洗液(BALF)中致炎及抗炎细胞因子的浓度;用流式细胞仪检测外周血及BALF中淋巴细胞亚群数,BALF中CD45~+淋巴细胞和非淋巴细胞数量以及CD4~+/CD8~+变化。结果肺组织病理学检查证实染毒后可致明显肺损伤。染毒2 h BALF中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)呈一过性升高,高浓度组较低浓度组更明显,之后下降;4 h白细胞介素-6(IL-6)、γ-干扰素(IFN-γ)开始升高,其中IL-6低浓度组较高浓度组明显,IFN-γ高浓度组较低浓度组明显,至12 h达高峰,24 h开始下降,但仍高于正常对照组水平(P＜0．05或P＜0．01);6～24 h IL-10与正常对照组比较均显著升高,尤以24 h明显(P＜0．05或P＜0．01)。外周血及BALF中CD4~+、CD8~+、自然杀伤细胞、B细胞及总T细胞均较正常对照组明显下降(P＜0．05或P＜0．01)。BALF中CD45~+淋巴细胞数和CD4~+/CD8~+均较正常对照组明显减少,非淋巴细胞数较正常对照组明显增多,且高浓度组较低浓度组变化趋势明显(P＜0．05或P＜0．01)。结论重度烟雾吸入致吸入性ALI的过程中伴有持续且过度的肺自然免疫反应,这种自然免疫反应部分由活化的中性粒细胞及巨噬细胞所介导;而肺特异性免疫反应受到明显的抑制。     

流式细胞术检测CFSE标记人T细胞亚群增殖反应

目的探讨应用流式细胞术和活细胞荧光染料CFSE检测T淋巴细胞各亚群增殖反应的方法学。方法人外周血单个核细胞（PBMC）经CFSE染色后,分别用植物凝血素（PHA）、CD3 mAb和结核杆菌抗原（Mtb-Ag）刺激,加IL-2扩增后,用流式细胞术检测活化增殖后T细胞各亚群的比例,并用ModFit软件分析各亚群的增殖动力模型。结果PHA和CD3 mAb主要活化总T细胞,CD8^＋T细胞的增殖优于CD4^＋T细胞,但CD4^＋T细胞前4代细胞明显多于CD8^＋T细胞。Mtb-Ag主要刺激γδT细胞增殖。结论以CFSE标记淋巴细胞,结合流式细胞术可有效检测出不同T细胞亚群对不同刺激剂的增殖反应以及增殖动力学变化。     

壳聚糖介导真核双表达质粒plRES—hVEGF｜2｜cDNA／hBMP-4转染兔骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化

背景：发展一种安全有效的方法来促进骨缺损是修复重建外科面临的重要问题,自体骨移植仍是目前优先考虑的选择,但供区有限且不可避免地对供区造成新的损害;同种异体骨移植存在免疫排斥反应;非骨性材料移植物在临床实践中的并发症仍居高不下。目的：探讨壳聚糖介导真核双表达质粒pIRES-hVEGF｜2｜cDNA/hBMP-4转染兔骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的可行性。设计、时间及地点：细胞基因工程学体外实验,于2007-09/2008-04在安徽医科大学与中国医科大学完成。材料：清洁级新西兰大白兔8只,由安徽医科大学实验动物中心提供。壳聚糖介导的真核双表达质粒pIRES-hVEGF｜2｜cDNA/hBMP-4为课题组自行构建。方法：无菌条件下抽取兔骨髓,Percoll法体外分离培养骨髓间充质干细胞,通过换液和贴壁吹打法进行纯化扩增。第3代骨髓间充质干细胞80%融合后,按1×10^8L^-1密度接种,实验组采用壳聚糖介导的真核双表达质粒pIRES-hVEGF｜2｜cDNA/hBMP-4进行转染,对照组不转染质粒,继续以含10%FBS的L-DMEM普通培养基进行培养21d。主要观察指标：碱性磷酸酶及茜素红染色检测细胞分化情况,扫描电镜观察细胞结构变化。结果：转染14d后实验组碱性磷酸酶染色呈强阳性表达,茜素红染色出现大量棕红色的钙结节,电镜观察细胞内含有大量碱性磷酸酶的小泡,细胞周围大量基质分泌;对照组碱性磷酸酶与茜素红染色均呈阴性,电镜下细胞内几乎没有含碱性磷酸酶的小泡。结论：兔骨髓间充质干细胞在体外经壳聚糖介导的真核双表达质粒pIRES-hVEGF｜2｜cDNA/hBMP-4转染后,可定向分化为成骨细胞。     

检测NK细胞活性的三种方法的比较分析

检测ＮＫ细胞活性，经典的方法是同位素和法，但由于同位素的设备条件和防护等问题，使其应用受到限制，人们一直在探索能为临床接受的替代方法。本文的研究表明，ＭＴＴ还原法与ＬＤＨ释放法，均能用于ＮＫ细胞活性检测ＭＴＴ还原法的灵敏度优于ＬＤＨ释放法，且与＾３Ｈ－ＴｄＲ标记法有较了的相关性，是易于普及和推广应用的一种测定ＮＫ细胞活性的方法。     

大鼠脂肪干细胞体外定向诱导分化为脂肪细胞和成骨细胞的研究

目的研究大鼠脂肪干细胞的基本生物学特性及其向脂肪细胞和成骨细胞诱导分化潜能。方法取6周龄SD大鼠腹股沟处脂肪组织,胶原酶消化法分离出脂肪干细胞,体外培养。取第3代细胞,免疫细胞化学测定其CD44、CD34抗原表达,分别用成脂和成骨诱导培养液诱导其向脂肪细胞及成骨细胞分化。油红染色、碱性磷酸酶染色和vonKossa染色鉴定其分化能力。结果大鼠脂肪干细胞生长能力旺盛,表达CD44,而不表达CD34;定向诱导后,油红染色、碱性磷酸酶染色和vonKossa染色阳性。结论大鼠脂肪组织可分离培养出脂肪干细胞,能向脂肪细胞和成骨细胞诱导分化,有可能成为组织工程理想的种子细胞来源之一。     

真核双表达载体pIRES-hVEGF121 cDNA/hBMP-4的构建与鉴定

目的构建人血管内皮生长因子(hVEGF121)和人骨形态发生蛋白-4(hBMP-4)的真核双表达质粒,转染COS-7细胞并表达。方法将hVEGF121 cDNA和hBMP-4通过非定向和定向克隆至真核双表达质粒pIRES中,重组质粒pIRES-hVEGF121cDNA/hBMP-4,经酶切鉴定后,转染COS-7细胞,提取总RNA和总蛋白,进行RT-PCR和Western blot检测。结果真核双表达载体pIRES-hVEGF121cDNA/hBMP-4构建成功且hVEGF121cDNA和hBMP-4在COS-7细胞中得到了有效表达。结论hVEGF121和hBMP-4在COS-7细胞中成功表达,为进一步研究打下良好基础。     

1株表达人轮状病毒VP7的重组腺病毒的生物学特性鉴定

目的对表达轮状病毒VP7基因的1株重组腺病毒rvAdG1VP7(G)的生物学特性进行鉴定,为进一步免疫学研究打下基础.方法用rvAdG1VP7(G)感染293细胞,并分别应用电子显微镜技术以及Southern blot、PCR、RT-PCR和Western blot等分子生物学方法了解rvAdG1VP7(G)的形态、VP7基因整合、遗传稳定性、VP7基因在细胞内转录及表达等有关生物学特性.结果电子显微镜观察表明:rvAdG1VP7(G)具有典型的腺病毒形态;Southern blot、PCR、RT-PCR和Western blot等分子生物学方法分析显示:rvAdG1VP7(G)中确有特异性的VP7基因稳定整合,有较好的遗传稳定性,感染293细胞后能有效转录,可表达轮状病毒主要结构蛋白VP7.结论 rvAdG1VP7(G)具有良好的生物学性质,为进行体内实验研究提供了必要条件.     

呼吸道合胞病毒分泌型融合蛋白的真核表达和纯化

目的 研究人呼吸道合胞病毒(human respiratory syneytial viruse,RSV)分泌型融合蛋白(secreted fusion protein,sF)基因在杆状病毒中的表达及纯化.方法 根据编码F蛋白的基因序列设计引物,以PCR方法将F蛋白基因的跨膜区和胞质区核酸序列替换为6×His核酸序列.获得COOH'端带有His标签的重组sF-His蛋白编码基因,利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统,构建可表达sF蛋白的重组杆状病毒,用脂质体Cellfectine reagent转染sf9细胞,实现sF在sf9细胞中的表达,Ni柱亲和层析纯化sF蛋白.结果 成功获得了sF-His编码基因,构建的重组杆状病毒可高效表达sF,Ni-柱纯化后sF的浓度为1.084 mg/ml,纯度达90%以上.结论 杆状病毒系统是制备8F的有效方法,纯化的sF蛋白为RSV新型疫苗及单克隆抗体和诊断试剂等研究奠定了基础.