联合应用干扰素α及维甲酸对H_22肝癌细胞增殖、凋亡和移植瘤生长的影响

联合应用干扰素α及维甲酸对Ｈ_２２肝癌细胞增殖、凋亡和移植瘤生长的影响任秀宝，杨占凤，宋国培近年来，联用干扰素α（ＩＦＮα）及维甲酸（ＲＡ）治疗淋巴瘤、皮肤癌、宫颈癌、乳腺癌等肿瘤的研究取得了非常好的效果［１］。然而其在治疗肝癌方面，尚未见报道。为探?..     

球面对称设计在大肠杆菌JM109电穿孔转化优化试验中的应用

目的：探讨优化大肠杆菌JMl09菌株的电穿孔转化条件。方法：应用球面对称设计组合电穿孔转化条件，拟合出各条件与转化率之间的关系，对转化条件进行优化。结果：用电穿孔转化大肠杆菌JMl09菌株，可以得到高于化学方法的转化率。转化时间一定，外加电场强度，细菌生长状态、细菌密度是影响转化率的关键因素，而DNA的投入量对转化率无显著影响。结论：利用球面对称设计，可以获得细胞外源DNA分子电穿孔法导入的最优化条件。     

噬菌体呈现技术筛选抗黑色素瘤单链抗体

目的：制备黑色素瘤单抗的单链可变区片段，用于肿瘤的诊断或靶向治疗。方法：从杂交瘤细胞提取总RNA，分别扩增出轻重链可变区基因(variable region of heavy chain，VH和variable region of light chain，VLDNA)，连接形成单链抗体(single chain fragment variable region，ScFv)DNA，将SeFv与载体pCANTAB 5E的连接产物转化大肠杆菌TGl，经M13K07超感染后，获得噬菌体抗体ScFvcDNA文库，用黑色素瘤细胞LiBr对重组的噬菌体抗体进行3轮吸附-洗脱-扩增亲和筛选后，随机挑选克隆经ELISA筛选鉴定。结果：vH、VL和ScFv分别约为360、330、750bp，从随机筛检的30个克隆中获得10个高亲和性噬菌体呈现型ScFv单克隆。结论：用噬菌体呈现技术制备的黑色素瘤ScFv，可为肿瘤的诊断和靶向治疗奠定基础。     

不同肝病患者血清异柠檬酸脱氢酶测定及临床意义

异柠檬酸脱氢酶（ＩＣＤ或ＩＣＤＨ）是体内重要的氧化还原酶，以ＮＡＤＰ＋为辅酶的ＩＣＤＨ主要分布于肝脏、心肌、骨骼肌和肾脏等组织，但只有在肝病时才明显升高。本文应用我院提供的ＩＣＤＨ试剂盒，测定１００例健康供血员及２００例不同肝病病人血清ＩＣＤＨ，其结果显示：肝病组ＩＣＤＨ升高，且明显高于对照组，ＩＣＤＨ升高与肝病程度呈正相关。说明ＩＣＤＨ对肝病诊断具有特异性，是反映肝实质细胞病变极为敏感的指标之一。     

GM-CSF基因修饰的肿瘤疫苗

肿瘤细胞瘤苗是最早的瘤苗形式,至今仍是人们研究的热点。近些年随着基因转染技术的发展,人们在增强用于疫苗的肿瘤细胞免疫原性方面做出了不懈的努力,其中采用了转基因的方式提高肿瘤疫苗的免疫效果。在众多转染细胞因子的瘤苗中,转染粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）基因的肿瘤疫苗效果相对显著。GM-CSF是一种强烈刺激巨噬细胞和树突细胞等抗原呈递细胞的增殖、分化、活化、成熟和趋化的细胞因子。GM-CSF基因修饰的肿瘤细胞用放射线灭活后体内注射,可增加局部炎性反应,大量多核细胞、巨噬细胞、树突状细胞（DC）浸润,促进了肿瘤抗原的呈递,能够诱导强烈的抗肿瘤免疫反应。GM-CSF转导疫苗为GVAX系列肿瘤疫苗,对GVAX肿瘤疫苗进行了大量的I/Ⅱ期临床研究,其中包括黑色素瘤、前列腺癌、非小细胞肺癌（NSCLC）和肾癌。这些临床试验均证实这种方法是十分安全的,并能有效刺激机体产生抗肿瘤免疫反应。     

应用肝移植供体脾淋巴细胞预防受体鼠肝癌复发的研究

目的 探讨肝癌肝移植后应用活化供体脾脏来源的淋巴细胞,对受体实施过继性免疫治疗以预防肝癌复发的可行性.方法 以培养黏附法体外分离培养Wistar大鼠骨髓树突状细胞(DCs)前体细胞,经诱导后与Wistar大鼠肝癌细胞CBRH-7919裂解物抗原共同孵育,形成负载癌抗原的DCs.以此DCs分别诱导受体(Wistar大鼠)、供体(SD大鼠)来源的脾淋巴细胞作为两个实验组C(受体活化组)、D(供体活化组),以未经抗原诱导的受、供体脾淋巴细胞作为对照组A(受体对照组)、B(供体对照组).对比活化、非活化以及供体来源、受体来源的脾淋巴细胞在体外对受体肿瘤细胞的杀伤活性.以上述不同来源和处理的脾淋巴细胞对SD→Wistar大鼠肝移植后肿瘤复发模型行过继性免疫治疗,以盐水治疗作为对照组E,每组6只大鼠,观察各组免疫治疗对于肿瘤浸润淋巴细胞、受体肝脏成瘤率和供肝的排斥反应的影响.结果 DCs诱导脾细胞过程中,培养上清液γ干扰素(IFN-γ)分泌C、D组较A、B组有明显的升高.C、D组对肝癌细胞的杀伤活性较A、B组显著增强,D组较C组显著增强.D组脾细胞回输体内后,在移植后大鼠体内观察到了肿瘤浸润淋巴细胞增多,肿瘤组织坏死和成瘤率下降.免疫治疗前后供肝未见严重排斥反应发生.结论 活化的供体脾细胞较受体脾细胞有更强的肿瘤杀伤效果.应用供体脾淋巴细胞对肝移植受体进行过继性免疫治疗可以在不增加对移植肝排斥反应的同时,为预防肝癌肝移植术后复发、延长生存提供一种可能的方法.     

iASPP真核表达载体的构建及其对NIH3T3细胞增殖的影响

目的：构建iASPP真核表达载体,稳定转染小鼠成纤维细胞（NIH3T3）并检测其表达,观察其对NIH3T3细胞增殖的影响。方法：设计引物以源克隆PCMV-iASPP为模板PCR扩增其中的CDS区,亚克隆入FLAG-pcDNA3.0,将该重组质粒转化DH5α感受态大肠埃希菌,筛选阳性克隆,经酶切、测序鉴定后,用脂质体介导转染NIH3T3细胞,G418加压筛选28 d,RT-PCR、West-ern blotting检测基因、蛋白表达;MTT法观察细胞增殖能力。结果：重组质粒鉴定正确,筛选所得阳性克隆中可以检测到iASPP基因的转录和表达,且该iASPP阳性表达细胞株增殖能力明显增强。结论：成功构建iASPP真核表达载体并成功构建稳定表达iASPP的NIH3T3细胞株,证明该基因的稳定表达在体外能显著增强NIH3T3细胞增殖能力。     

sCD80-Linker-sCD40L融合基因腺病毒载体的构建

目的 :构建携带sCD80-Linker -sCD40L融合基因的复制缺陷型腺病毒载体。方法 :在GenBank检索人CD80、CD40L及IL -12b编码基因序列 ,确定扩增区域 ,设计引物。以Trizol抽提人外周血单个核细胞总RNA ,使用RT -PCR方法获得IL -12b信号肽、sCD80、sCD40L等基因的编码序列 ,并分别克隆入T载体。重叠PCR构建sCD80 -Linker -sCD40L融合基因 ,克隆入T载体。使用Stratagene公司AdEasyXLAdenoviralVectorSystem试剂盒构建携带sCD80 -Linker -sCD40L融合基因的复制缺陷型腺病毒载体。结果 :经测序证实 ,正确克隆了人IL -12b信号肽、sCD80、sCD40L编码序列 ,构建了携带sCD80-Linker-sCD40L融合基因的T载体 ,并进一步构建了携带sCD80 -Linker -sCD40L融合基因的复制缺陷型腺病毒载体。本实验病毒滴度为2×1010cfu/ml。结论 :成功构建了携带sCD80 -Linker -sCD40L融合基因的复制缺陷型腺病毒载体。     

肝癌肝移植术后肝癌复发大鼠模型的建立

目的通过在大鼠肝癌肝移植后免疫抑制状态下接种肿瘤组织块来模拟临床中同种异体肝移植后肝癌复发的进程,建立稳定的肝移植后肝癌复发模型。方法应用Wistar大鼠肝癌细胞系CBRH-7919经过培养传代、皮下成瘤、肝内接种等过程建立大鼠的种植性肝癌模型。行SD→Wistar的大鼠移植,免疫抑制状态下肝内植入瘤块。A组(n=15),以免疫抑制状态下的未行肝移植的Wistar大鼠肝内植瘤,作为对照组;B组(n=15),为肝移植术中植瘤组;C组(n=15),为术后1周植瘤组。观察各组大鼠的成瘤率,在B超下观察肿瘤生长情况,绘制生长曲线。结果肝移植术中植瘤组(B组)大鼠仅6只成瘤,成瘤率为40.0%,而对照组(A组)和术后植瘤组(C组)大鼠各有13只成瘤,成瘤率为86.7%。术中植瘤组大鼠肿瘤生长速度明显降低。结论肝移植术后1周在免疫抑制状态下肝内接种瘤块成瘤,建立了安全、可靠的肝移植术后肝癌复发的大鼠模型。     

p53基因修饰树突细胞诱导特异性抗肿瘤免疫应答的实验研究

目的　探讨含p5 3基因的质粒pC5 3 SN3转染的树突细胞 (DC)体外诱导特异性抗肿瘤细胞毒性T淋巴细胞 (CTL)。方法　应用脂质体介导将质粒pC5 3 SN3转染肺癌患者单个核细胞 [HLA A2 + ]衍生的DC ,然后与未经纯化的自体T细胞混合培养以诱导CTL(T pC5 3 SN3) ,并通过乳酸脱氢酶(LDH)释放实验测定其对p5 3基因突变的HLA A2 + 人肺癌细胞系Calu 6的杀伤活性。结果　用质粒pC5 3 SN3转染DC后 ,发现CD1a、CD83显著升高 ,转染前表达率分别为 (5 .4 5± 0 .89) %、(3.2 6± 0 .4 7) % ,转染后分别为 (5 2 .15± 11.5 6 ) %、(2 5 .78± 12 .35 ) %。但CD86 、CD4 0 、HLA DR等DC相关标志与转染前无明显改变。LDH释放实验显示 ,以Calu 6作为靶细胞 ,T pC5 3 SN3诱导的杀伤作用显著高于T IL 2(IL 2 10 0U ml刺激外周血单个核细胞产生的CTL) ,效靶比为 10∶1时其杀伤活性分别为 (5 6 .79±15 .6 7) %和 (39.33± 9.88) %。同时细胞表面标记检测可见T pC5 3 SN3细胞中以CD8+ 细胞为主 ,且CD6 9、CD4 5RO CD8表达均显著升高。结论　p5 3基因修饰的DC对p5 3突变的人肺癌细胞系可有效诱导HLA A2限制的特异性CTL。