稳定表达突变减毒志贺样毒素Ⅰ的CHO细胞株的建立与鉴定

目的:建立稳定表达突变减毒志贺样毒素Ⅰ(Stx1)的CHO细胞株。方法:用脂质体介导将突变减毒Stx1真核表达载体pcDNA3.1-Stx1D10、pcDNA3.1-Stx1D100转染中国仓鼠卵巢细胞系CHO,G418筛选抗性克隆,PCR、RT-PCR、Western blot等方法检测阳性细胞株,有限稀释法获得稳定表达突变减毒Stx1的CHO细胞株。检测阳性细胞株的培养上清对人卵巢癌细胞SKOV3的生长抑制作用,并使用Stx 1 B亚基抗体对该作用进行阻断。结果:经2次克隆化获得稳定表达突变减毒Stx1的基因工程细胞株,Western blot检测和SKOV3细胞生长抑制实验证实该细胞株可以分泌突变减毒Stx1,该毒素对SKOV3细胞具有生长抑制作用且该作用可以被Stx1 B亚基抗体阻断。结论:成功地建立了分泌性表达突变减毒Stx1的CHO细胞株,命名为CHO/Stx1D10和CHO/Stx1D100。证实Stx1的天然信号肽可以被真核细胞识别从而使其被真核细胞分泌性表达。     

Vav1在吲哚胺2,3双加氧酶抑制T细胞中的作用初探

目的:探讨吲哚胺2,3双加氧酶(IDO)抑制T细胞中信号传导分子Vav1的分子机制.方法:应用稳定表达IDO的CHO细胞株,与纯化的外周血T细胞共孵育,检测IDO抑制T细胞增殖,诱导凋亡的情况,通过semi-quantitative RT-PCR检测T细胞中Vav1、IL-2 mRNA表达变化;Western blot及免疫沉淀技术检测Vav1蛋白表达及活化情况.结果:IDO可抑制T细胞的增殖.T细胞中Vav1和IL-2 mRNA水平明显下降(P<0.05).而且,IDO还能使Vav1蛋白的表达和磷酸化水平降低.结论:研究证实在肿瘤局部产生于抗原呈递细胞或肿瘤细胞的IDO,可能通过抑制细胞内重要的信号传导蛋白Vav1的表达和磷酸化过程,使肿瘤浸润淋巴细胞的主动免疫受损,有利于肿瘤发生免疫逃逸.     

警报素家族研究进展

警报素最早在2004年提出,是一类可应答于危险因子,对固有免疫细胞具有趋化和激活作用,可激发和促进适应性免疫应答的内源性生物介质。目前公认的警报素家族成员主要来自防御素家族,抗菌肽家族,嗜酸粒细胞衍生神经毒素和高迁移率族蛋白等。在炎症或损伤因素的刺激下,警报素能够迅速地从储存部位释放。警报素可以通过促进抗原的摄取、处理和呈递来增强对抗原特异性免疫反应的诱导,是一类可增强免疫活性的佐剂。对警报素家族深入研究将有助于阐明其在免疫系统中的地位,并可能为免疫治疗提供新的手段或靶点。     

人胸腺基质淋巴生成素的研究进展

人胸腺基质淋巴生成素(hTSLP)是一种结构类似IL-7的新型细胞因子.正常情况下其mRNA主要表达于基质细胞、上皮细胞和肥大细胞,病理状态下,TSLPmRNA在一些前炎症细胞因子的作用下表达增加.hTSLP直接作用的效应细胞主要是树突状细胞(DC),通过调节DC的成熟来发挥作用.一方面.hTSLP-DC在外周能够诱导初始T细胞向一类特殊的Th2细胞分化,从而启动炎症反应;另一方面,hTSLP-DC能够促进胸腺中CD4+CD25-T细胞分化成CD4+CD25+调节性T细胞,从而在免疫耐受的发生和调控中发挥作用.     

MUC1/Y基因真核表达载体构建及MUC1、MUC1/Y体外修饰DC诱导特异性抗肿瘤免疫应答

目的　构建MUC1 Y全长cDNA真核表达载体 ,并以MUC1及MUC1 Y真核表达载体修饰树突状细胞 (DC)诱导特异性抗肿瘤免疫。方法　构建MUC1 YDNA真核表达载体 ,选取 10例HLA A2乳腺癌患者 ,体外IL 4、GM CSF联合诱导DC ,并以pCDNA3.1 MUC1和pCDNA3.1 MUC1 Y转染DC ,同时以空载体为对照 ,以pIRES2 EGFP MUC1 Y观察转染效率 ,转染后DC与自体T细胞混合培养 ,诱导CTL。以MCF 7为特异性靶细胞 ,Raji为非特异性靶细胞 ,通过乳酸脱氢酶释放实验检测杀伤活性 ,以annexinⅤ FITC检测特异性CTL诱导靶细胞凋亡的情况。以ELISA法测定基因修饰后DC刺激自体T细胞分泌IFN γ的能力。结果　酶切鉴定及测序结果表明成功构建了MUC1 Y真核表达载体pIRES2 EGFP MUC1 Y和pCDNA3.1 MUC1 Y。pIRES2 EGFP MUC1 Y转染效率基本为 10 %左右 ,DC中MUC1表达率为 8%。杀伤实验表明T DC pCDNA3.1 MUC的杀伤活性为 6 4 % ,T DC pCDNA3.1 MUC1 Y为 4 6 %。这两组间差异有显著性 ,同时与对照组比较差异均有显著性。annexinⅤ FITC标记实验显示 ,T DC pCDNA3.1 MUC1对靶细胞的杀伤和诱导凋亡的能力显著高于T DC pCDNA3.1 MUC1 Y及对照组。基因修饰DC刺激自体T细胞分泌IFN γ的能力显著升高。结论　构建的真核表达载体pIRES2 EGFP MUC1 Y可用     

MUC1/Y基因体外冲击树突状细胞诱导抗瘤免疫反应

目的制备含MUC1/Y cDNA质粒转染的树突状细胞(DC),体外诱导杀伤细胞,研究其治疗消化道肿瘤的效果.方法构建MUC1/Y cDNA真核表达载体pIRES2-EGFP-MUC1/Y、pcDNA3.1-MUC1/Y.以pcDNA3.1-MUC/Y电转染8例HLA-A2(+)消化道肿瘤患者单个核细胞衍生的DC后,与自体T细胞混合培养,诱导CTL(T-pcDAN3.1-MUC1/Y).以SW620细胞[HLA-A2(+)、MUC1/Y(+)]为特异性靶细胞,Raji细胞[HLA-A2(-)、MUC1/Y(-)]和Lovo细胞[HLA-A2(-)、MUC1/Y(+)]为非特异性靶细胞,通过乳酸脱氢酶(LDH)释放实验测定杀伤活性,ELISA法检测基因修饰后DC刺激自体T细胞产生IFN-γ的能力,并以ANNEXIN V-FITC试剂盒检测特异性CTL诱导靶细胞凋亡情况.结果pIRES2-EGFP-MUC1/Y转染效率为8%左右.T-pcDAN3.1-MUC1/Y诱导的杀伤作用显著高于T-pcDNA3.1[pcDNA3.1(+)修饰DC诱导的CTL]和T-IL-2(IL-2刺激外周血单个核细胞产生的CTL),P＜0.05.而且T-pcDNA3.1-MUC1/Y对靶细胞的杀伤和诱导凋亡的能力显著高于对照组.基因修饰后的DC能刺激自体T细胞分泌高水平IFN-γ,与未转染的DC相比具有显著差异(P＜0.05).结论成功构建MUC1/Y全长cDNA真核表达载体.pIRES2-EGFP-MUC1/Y可用于真核细胞转染,通过观察转染效率,易于筛选阳性克隆;经pcDNA3.1-MUC1/Y修饰的DC可有效诱导特异性抗肿瘤免疫应答.     

巢式序列特异性引物PCR方法检测HLA单倍体相合供受者间母胎微嵌合的临床应用研究

目的探索临床应用巢式序列特异性引物聚合酶链式反应（PCR-SSP）方法检测HLA单倍体相合供受者间母胎微嵌合状态的可行性。方法选取25对拟行HLA单倍体相合造血干细胞移植治疗的实体肿瘤患者及其供者,供受者为母子关系15例,父子关系10例。采集供受者外周血提取基因组DNA,采用巢式PCR-SSP方法检测患者外周血中供者来源的HLA-DRB1位点,并计算母胎微嵌合阳性率。随机选取经巢式PCR-SSP证实嵌合阳性和阴性且供受者性别不同的患者各4例,采用荧光原位杂交（FISH）技术进行重复检测,并与巢式PCR-SSP方法的检测阳性率进行比较,同时采用噻唑蓝法检测这8例患者分别与其亲缘供者和HLA完全不相合无关第3人之间的混合淋巴细胞增殖反应（MLR）,并计算增殖指数（SI）。结果巢式PCR-SSP方法灵敏度可高达0.001%,并具有较好的特异性。巢式PCR-SSP检测显示,在母子移植关系患者中母胎微嵌合阳性检出率为40%（6/15）,而在父子移植关系患者中母胎微嵌合阳性检出率为0。巢式PCR-SSP方法的检测灵敏度与FISH技术相比明显增高,其检测阳性率分别为50%（4/8）和12.5%（1/8）。MLR检测显示,嵌合阳性患者对其亲缘供者和无关第3人外周血单个核细胞（PBMC）的SI分别为（0.949±0.023）、（1.320±0.095）,嵌合阴性患者对其亲缘供者和无关第3人PBMC的SI分别为（1.133±0.036）、（1.245±0.069）;嵌合阳性患者对其亲缘供者PBMC的增殖反应强度与嵌合阴性患者相比明显降低（P=0.001）,并且也显著低于其对无关第3人PBMC的增殖反应强度（P=0.003）。结论巢式PCR-SSP方法灵敏度高、特异性好,适用于临床HLA单倍体相合供受者间母胎微嵌合状态的快速检测。     

稳定表达膜结合型 CD40L 配体 CHO 细胞系的建立和鉴定

 目的 建立稳定表达膜结合型 CD40 配体（CD40L）的 CHO 细胞系。 方法 将编码膜结合型 CD40L 的重组质粒 pcDNA3.1- fCD40L 用 BgI Ⅱ 和 XhoⅠ 酶进行双酶切鉴定。电穿孔法向 CHO 细胞转染该重组质粒，G418 筛选抗性克隆，有限稀释法获取单克隆阳性细胞后扩大培养，获得 2 个整合了 fCD40L 基因的 CHO 细胞（CHO-fCD40L）克隆。用 RT-PCR、流式细胞仪分别从 RNA 和蛋白质水平对 2 个CHO-fCD40L 克隆细胞中膜结合型 CD40L 的表达进行检测；ELISA 法检测 2 个 CHO-fCD40L 克隆细胞培养上清液中可溶性 CD40L（sCD40L）的含量。 结果 重组质粒 pcDNA3.1-fCD40L 经双酶切和电泳检测到符合预期大小的基因片段。该重组质粒转染 CHO 细胞后经克隆化培养获得 2 个 CHO-fCD40L 克隆，分别命名为 C10、E11。RT-PCR 检测显示 C10、E11 细胞中有膜结合型 CD40L mRNA 的转录；流式细胞仪检测显示 C10、E11 细胞表达 CD40L 蛋白达 90% 以上；ELISA 法检测到显示 C10、E11 细胞培养液上清中有 sCD40L 蛋白表达。 结论 成功获得稳定表达膜结合型 CD40L 的 CHO 细胞系，为比较膜结合型 CD40L 与 sCD40L 的生物学功能奠定了良好基础。     

髓系来源抑制细胞促进肿瘤免疫逃逸的研究进展

髓系来源抑制细胞(MDSC)是髓系来源的一群异质细胞,在荷瘤小鼠模型及肿瘤患者均发挥免疫抑制作用.肿瘤MDSC免疫逃逸作用的机制目前已取得了很多进展,这群细胞可以通过上调精氨酸酶1(ARN1),诱导一氧化氮合酶(iNOS or NOS-2)表达,增加一氧化氮(NO)、活化氧自由基(ROS)等的释放,分解肿瘤微环境中的半...     

CD40/CD40L交联在CD4+T细胞诱导肿瘤细胞凋亡中的机制研究

目的探讨CD40/CD40L交联在CIK细胞中CD4 T细胞(CD4 CIK)诱导肿瘤细胞凋亡中的作用机制.方法体外扩增CIK细胞并纯化CD4 T细胞亚群,AnnexinV染色法观察CD4 CIK诱导肿瘤细胞凋亡的作用;半定量PCR、流式细胞法及ELISA法比较CD4 CIK激活前后CD40L的表达变化;将转染质粒pIRES2-EGFP-sCD40L的CHO细胞(CHO-sCD40L)与乳腺癌细胞T47D共孵育,监测24小时后其表面分子Fas的表达变化及对Fas介导凋亡的敏感性.结果CD4 CIK细胞可诱导肿瘤细胞凋亡,凋亡率随孵育时间和效靶比的升高而增加,且肿瘤细胞表面分子Fas水平升高,可从1.98%±0.23%升高到31.62%±7.07%;CD4 CIK细胞被激活后,CD40L表达水平均较激活前明显增加;成功转染的CHO-sCD40L细胞与T47D共培养后,T47D表面分子Fas可被诱导升高,加入CH-11 24小时后可观察到明显T47D细胞的凋亡.结论CD4 CIK可能通过CD40/CD40L交联提升肿瘤细胞表面功能性Fas表达来诱导其凋亡.