旋毛虫新生幼虫T668重组抗原对小鼠的保护性免疫

目的研究旋毛虫新生幼虫T668重组抗原的免疫原性,制备基因工程疫苗。方法以旋毛虫新生幼虫期特异性基因T668在大肠杆菌中的表达蛋白为抗原免疫小鼠,每间隔10d免疫1次,共免疫3次。末次免疫后10d,每只小鼠攻击感染200条旋毛虫感染性肌幼虫,感染后5周用消化法检查肌幼虫(ML)负荷。结果T668重组抗原免疫组肌幼虫减虫率明显高于佐剂组和对照组。结论T668重组抗原能诱导小鼠产生一定程度的保护性免疫,且可激发特异性体液免疫。     

多头带绦虫成虫和幼虫的iTRAQ蛋白质组学分析

目的 分析多头带绦虫成虫和幼虫样本中的差异蛋白定量结果,为筛选调节寄生虫发育和生长的特定蛋白奠定基础。方法 提取多头带绦虫成虫与脑多头蚴原头节蛋白质样本进行SDS-PAGE电泳分析后,采用同位素标记相对与绝对定量技术(iTRAQ)技术和液相串联质谱(LC-MS/MS)分析,当两种样品蛋白的差异倍数达到1.5倍以上,且经检验有统计学意义时,视为差异蛋白。结果 本研究共鉴定了684个蛋白,其中130个差异表达蛋白,相对于幼虫,成虫上调蛋白69个,分别为副肌球蛋白,果糖-1,6-二磷酸酶,钙结合蛋白,六钩蚴蛋白Tso22c,热休克蛋白70,8 kDa糖蛋白,肌球蛋白轻链,钙调蛋白等;成虫下调蛋白61个,分别是抗原cC1,钙蛋白酶,膜联蛋白B3,皮层蛋白,糖脂转移蛋白,微管相关蛋白,乳酸脱氢酶B,xpa-结合蛋白等。通过实时定量PCR验证了10个差异明显的蛋白。另外,差异蛋白路径注释中约30%的蛋白参与了代谢途径和次生代谢物的生物合成。结论 本研究为多头带绦虫发育、生活史及寄生虫-宿主的互作机制研究提供了基线资料。     

旋毛虫成虫期特异性基因全长cDNA的克隆与序列分析

目的获取编码旋毛虫5日龄成虫(AD5)期特异性基因完整开放阅读框架(openreadingframe,ORF)cD-NA分子。方法利用地高辛标记的AD5期特异性cDNA片段T671作为探针对AD5cDNA文库进行核酸杂交筛选,将筛选出的阳性克隆进行测序,利用分子生物学软件进行分析。结果获得1个全长1132bp的cDNA分子,该cD-NA含有1个1032bp完整的ORF,该ORF编码1个343个氨基酸残基组成的多肽,其分子量理论推导值为35.1kDa,等电点(isoelectricpoint,IP)为4.8。InterProScan分析显示117～120氨基酸残基(SGYG)为粘多糖结合位点,27～86氨基酸残基为一线虫表皮胶原蛋白N-末端区结构域,153～328氨基酸残基为胶原蛋白螺旋三联体重复区(G-x-y)结构域。SignalPV2.0分析显示,在1～43氨基酸区域为信号肽。Blastn同源性分析表明,与其它已知生物基因序列无明显的同源性,为一新的cDNA分子。但与表皮胶原蛋白同源性较高,大于40％。结论筛选获得一个新的编码AD5期特异性基因的完整ORF的cDNA分子。     

旋毛虫新生幼虫cDNA文库的免疫筛选

目的　获取具有抗原性的旋毛虫新生幼虫基因。　方法　以旋毛虫感染猪血清为抗体探针,对旋毛虫新生幼虫cDNA文库进行免疫筛选,将获得的阳性克隆进行测序及分析。结果　从45×105旋毛虫新生幼虫cDNA文库重组子中共获得158个阳性克隆。序列分析结果表明,其中有36个新的cDNA序列,已报道的序列有5个,有12个序列无开放阅读框架(ORF),与旋毛虫线粒体基因组DNA同源。　结论　获得具有抗原性的旋毛虫抗原编码cDNA分子     

旋毛虫新生幼虫期特异性T668 cDNA在大肠埃希菌中的表达及鉴定

目的 对旋毛虫新生幼虫期特异性T668 cDNA进行表达及鉴定，以获得基因工程抗原。方法 应用PCR技术，从pBK-CMv-T668重组质粒中扩增到不含信号肽序列的T668cDNA片段，将目的基因克隆于原核表达载体pET28a( )，构建pETT668重组质粒，再将其转化到E．coli表达菌株DE3感受态细胞中，经IPTG诱导表达，以SDSPAGE鉴定表达产物。结果 pETT668表达蛋白的分子质量单位为49ku，且随诱导时间的延长蛋白表达量逐渐增加，诱导5h时表达量达到高峰；薄层扫描结果显示，目的蛋白占菌体总蛋白的34．6％。Western-blotting检测显示，表达蛋白可被感染旋毛虫家猪血清所识别。结论 旋毛虫新生幼虫期特异性T668基因在大肠埃希菌中获得高效表达，且表达蛋白具有良好的抗原性。