多头带绦虫脑多头蚴cDNA表达文库的构建及初步分析

从甘肃景泰羊源脑多头蚴原头节提取总RNA,以Oligo(dT)纤维素柱纯化mRNA,利用Lambda ZAP II XR文库构建试剂盒构建了脑多头蚴cDNA表达文库.从构建的原始文库随机挑选单个噬菌斑进行PCR,确定文库重组率和插入外源基因片段大小,鉴定文库质量.结果表明脑多头蚴cDNA表达文库的原始库容量为1.0×1...     

旋毛虫编码新生幼虫p46 kDa抗原基因重组融合蛋白对小鼠的免疫保护性研究

目的 探讨旋毛虫编码新生幼虫p46 kDa抗原基因重组融合蛋白WN10对小鼠的免疫保护性。方法 将纯化的重组融合蛋白WN10以20μg/只的剂量分3次免疫小鼠后，攻击感染旋毛虫肌幼虫200条／只，检查旋毛虫7日龄成虫数、雌虫体外产生新生幼虫数、感染35d的肌幼虫数并计算减虫率，同时用ELISA法检测血清中抗WN10抗体IgG滴度。结果WN10免疫小鼠后获得旋毛虫7日龄成虫、肌幼虫的减虫率分别为64．28％和61．21％，均与感染对照组和佐剂对照组差异显著；获得雌虫产新生幼虫的减虫率为16．46％，与感染对照组和佐剂对照组差异不显著；WN10免疫组小鼠在第3次免疫后1周可检测到高滴度的抗WN10抗体IgG，在攻击感染旋毛虫9周后仍维持在较高水平。结论 编码旋毛虫新生幼虫p46 kDa抗原基因重组融合蛋白可诱导小鼠产生较强的抗旋毛虫保护性免疫。     

多头带绦虫甘肃分离株分子COⅠ基因部分序列比较分析

应用线粒体DNA中的细胞色素c氧化酶亚基I（COI）基因作为分子标记,对我国甘肃省景泰和平凉地区10个绵羊源脑多头蚴进行分析,与已知带属绦虫种的相应序列进行相似性比较,下载GenBank数据库的带属绦虫COI基因片段序列构建系统进化树,分析其分类及亲缘关系.结果表明,所有多头带绦虫分离株均成功扩增出444 bp的COI基因片段,去除引物序列后多头带绦虫分离株的COI基因片段为396 bp,可以分为4类,共有5个核苷酸变异位点,变异率为0.25%～1.26%.基于COI核苷酸序列的系统进化树表明所有T.multiceps分离株构成一个分支,可分为2个亚群.T.multiceps与T.krabbei 的亲缘关系最近,其次为T.serialis,T.asiatica,T.saginata,与T.ovis等其他带属绦虫关系较远,与T.mustelae关系最远.COI基因序列在种内相对保守,又存在一定的种间差异,可作为带属绦虫分类鉴定研究的分子标记.     

旋毛虫5日龄成虫期特异性基因的筛选与序列分析

目的　获得旋毛虫 5日龄成虫期特异性基因序列。方法　应用旋毛虫 5日龄成虫期待异性探针对 5日龄成虫cDNA文库进行杂交筛选、克隆测序及核苷酸序列数据库 (GenBank)查寻比较 ,登陆InterProScan进行基因、氨基酸序列分析。结果　利用消减杂交 (subtractedhybridization)获得的旋毛虫 5日龄成虫期特异性探针筛选 5日龄成虫cDNA文库 ,获得一个长 1 1 32bp的基因。其开放阅读框架由 1 0 30个核苷酸组成 ,编码 343个氨基酸。序列分析表明 ,该序列是一个尚未见报道的旋毛虫基因序列 ,在序列 1 1 7～ 1 2 0位氨基酸为氨基葡聚糖 (GAG)结合位点 ,在 2 7～ 86 ,1 5 3～ 32 8位氨基酸处存在Gly -X -Y胶原蛋白重复序列 ,分别编码两个胶原蛋白多肽。结论　获得旋毛虫 5日龄成虫期特异性基因 ,其编码产物为表皮胶原蛋白     

旋毛虫新生幼虫p46000抗原基因的表达与抗原性分析

目的　对旋毛虫新生幼虫p46000抗原基因进行原核表达并检测重组抗原的抗原性。　方法　利用聚合酶链反应 (PCR)扩增目的基因 ,克隆到原核表达载体 pET-28a ,构建重组表达质粒 ,经酶切及测序鉴定后转化大肠埃希菌BL21(DE3 ),以异丙基-β-D 硫代半乳糖苷诱导表达。十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS-PAGE)、酶联免疫吸附测定 (ELISA)和蛋白质印迹法 (Western blotting)分析表达产物。　结果　 SDS-PAGE结果显示表达产物的分子量约为Mr 48000 ,与理论值相符。ELISA和Western blotting结果表明 ,重组蛋白可被旋毛虫感染的猪血清和兔抗重组蛋白血清识别 ;兔抗重组蛋白血清可识别旋毛虫新生幼虫抗原Mr 46000蛋白。　结论　成功表达了旋毛虫新生幼虫p46000抗原基因 ,重组抗原具有良好的抗原性。     

旋毛虫肌幼虫p43cDNA的克隆及鉴定

目的 克隆旋毛虫肌幼虫p43cDNA并对其表达的融合蛋白酶活性进行鉴定与分析。 方法 用PCR技术从旋毛虫肌幼虫cDNA文库中扩增靶基因，克隆到pMD?鄄18T载体，转化至大肠埃希菌NovaBlue，序列测定后克隆到原核表达载体pET28a并转入表达菌DE3中。经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达后提取包涵体并复性，通过降解双链λDNA测定其融合蛋白脱氧核糖核酸酶II（DNase II）活性。 结果 成功克隆到p43 cDNA序列，该cDNA序列与美国发表的存在两个核苷酸的变异，分别为第210位的C变为T，第604位的A变为G。基于3名研究者从旋毛虫T. spiralis美国分离株获得的序列相同、6名国内研究者（含本课题组）从T. spiralis中国分离株获得的序列也相同，由此可以确定这两个核苷酸的变异为T. spiralis中国分离株特异性和特征性单核苷酸多态性（SNP）标记。p43重组蛋白能够降解双链λDNA，表明其有DNase II酶活性。 结论 成功克隆到p43cDNA，T. spiralis中国分离株的p43cDNA具有两个SNP标记，其表达的重组蛋白具有DNase II酶活性。     

旋毛虫病动物被动免疫转移试验研究

旋毛虫病是全球性分布的人兽共患寄生虫病，它不仅在畜牧业生产上造成严重的经济损失，而且对人类的健康构成严重威胁。目前国内外学者对旋毛虫病的免疫研究十分重视，但关于宿主对旋毛虫感染的保护性免疫机理尚不完全清楚，国内报道较少，为此我们对旋毛虫感染及抗原免疫后的被动免疫转移进行了研究，为进一步研究旋毛虫感染的免疫机理奠定基础。材料与方法１　旋毛虫虫种为本实验室用大白鼠传代保种的长春犬株旋毛虫。２　实验动物２．１　小鼠　本所动物场饲养的一级昆明种，体重２０～２２ｇ。２．２　大鼠　购自兰州医学院动物场，为普…     

寄生性蠕虫过氧化物氧还蛋白研究进展

过氧化物氧还蛋白为广泛存在于需氧生物体的过氧化物酶家族抗氧化蛋白。寄生性蠕虫过氧化物氧还蛋白不仅可以清除虫体自身代谢产生的活性氧族分子(reactive oxygen species,ROS)和活性氮族分子(reactive nitrogen species,RNS),而且在抗御宿主免疫细胞产生的ROS和RNS的潜在损伤中起着至关重要的作用。本文综述了过氧化物氧还蛋白的分类、作用机制以及寄生性蠕虫(包括吸虫、绦虫和线虫)过氧化物氧还蛋白的研究进展。     

细粒棘球绦虫硫氧还蛋白过氧化物酶基因的表达及抗原性分析

目的在原核系统表达并初步鉴定细粒棘球绦虫硫氧还蛋白过氧化物酶(EgTPx)基因重组蛋白的抗原性。方法对已构建的重组质粒pMD-18T-EgTPx进行限制性酶切,获取目的基因片段后连接到表达质粒载体pET30a,构建重组表达质粒pET30a-EgTPx,转化大肠杆菌DH5α。筛选阳性克隆,经限制性酶切分析、PCR及测序鉴定后,转化大肠杆菌BL21(DE3),以异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析表达产物,对表达产物纯化后用Western-blot方法和ELISA鉴定重组EgTPx蛋白的抗原性。结果构建的重组表达质粒pET30a-EgTPx阳性克隆经PCR与双酶切鉴定,与预期结果一致,测序鉴定无基因突变,开放阅读框正确;含有pET30a-EgTPx重组表达质粒的大肠杆菌BL21(DE3)诱导后得到了高效表达,SDS-PAGE显示表达产物分子量约为27 kDa,而且主要以包涵体形式存在;Western-blot和ELISA结果表明EgTPx重组抗原可以被棘球蚴感染羊阳性血清特异性识别。结论成功构建了pET30a-EgTPx表达质粒,EgTPx重组蛋白得到了高效表达,表达产物具有良好的抗原性。