α-突触核蛋白和葡糖脑苷脂酶在食蟹猴不同脑区的表达

目的研究α-突触核蛋白(α-synuclein,α-Syn)及葡糖脑苷脂酶(glucocerebrosidase,GCase,GBA)在食蟹猴不同脑区的表达。方法 Western blotting方法及免疫组织化学法检测α-Syn和GBA在食蟹猴纹状体和小脑皮质的表达。酶活性分析法检测GBA活性。免疫荧光双重标记法观察α-Syn和GBA的共定位。结果α-Syn和GBA在胞质和神经末梢中存在共定位。α-Syn、GBA在纹状体和小脑部位均有表达,但α-Syn在纹状体表达量高于小脑,而GBA在纹状体表达量低于小脑。此外,纹状体的GBA酶活性低于小脑。结论不同脑区α-Syn、GBA表达量不同,α-Syn表达量与GBA表达量呈反向关系。     

低氧预适应可减少缺氧—复氧后大鼠海马培养神经元凋亡

用原位末端标记 ( TUNEL )法观察低氧预适应对大鼠海马培养神经元缺氧 -复氧后神经元凋亡的影响。结果显示 ,经低氧预适应的海马神经元缺氧 -复氧后凋亡神经元百分率明显低于对照组。本结果表明 ,低氧预适应可使体外培养的海马神经元对缺氧产生耐受 ,减少缺氧 -复氧后的海马神经元凋亡     

制备与鉴定导致家族性帕金森病突变蛋白质的α-突触核蛋白聚合体

目的：制备和鉴定与家族性帕金森病发病有关的α-突触核蛋白突变体A53T与A30P的聚合体，为帕金森病患者的治疗乃至康复干预提供重要理论基础及靶点。方法：实验于2004—01／05在首都医科大学宣武医院北京老年医学研究所神经生物研究室完成。设计含适当酶切位点的聚合酶链反应引物，用聚合酶链反应法从质粒pBS-α-突触核蛋白(A53T)和pBS-α-突触核蛋白(A30P)合成α-突触核蛋白突变DNA，并将其亚克隆至谷胱甘肽巯基转移酶融合表达载体pGEX-4T-1。转化大肠杆菌B121，以异丙基-D-硫代半乳糖苷诱导，使其表达融合蛋白GST-α-突触核蛋白(A53T)和GST-α-突触核蛋白(A30P)。用凝血酶定点分解融合蛋白，并用亲和层析法纯化突变的基因重组型人α-突触核蛋白。将重组蛋白在37℃下孵育2h制备蛋白聚合体。所制备聚合体用Westem blot分析法和透射电镜鉴定。结果：DNA测序结果证明构建载体插入正确α-突触核蛋白突变体A53T与A30P基因。基因表达产物在十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳上表现为单一条带，分子量约为18ku，与所报道的该蛋白的分子量一致。Westem blot分析表明，所表达蛋白可被α-突触核蛋白特异性抗体识别，证明表达的重组蛋白为α-突触核蛋白，聚合后的α-突触核蛋白在108ku左右，相当于六聚体。聚合体在电镜下呈短的丝状结构。结论：制备出人重组α-突触核蛋白突变体A53T与A30P并建立其聚合体模型，这为帕金森病的病因研究提供重要的物质基础从而为帕金森病患者的康复提供新的靶点。     

α-突触核蛋白对酪氨酸羟化酶基因启动子的影响(英文)

目的探讨α-突触核蛋白对多巴胺代谢的调节机制。方法以人基因组DNA为模板,PCR法扩增酪氨酸羟化酶(Tyrosine Hydroxylase, TH)基因区的部分DNA片段(-495~+25),将其插入质粒pGL3-Basic,构建荧光素酶报告基因重组质粒pGL3-THprom,转染多巴胺能神经元细胞系MES23.5和MES23.5/hα-Syn+。结果双荧光素酶活性分析表明,pGL3-Basic、pGL3-THprom和pGL3-Control在MES23.5细胞中表达的荧光素酶活性分别为5.60±0.67, 26.80±4.11和32.90±4.75,而pGL3-THprom在MES23.5和MES23.5/hα-Syn+中表达的荧光素酶活性分别为26.80±4.11和14.40±0.61,差异极显著(P<0.01)。结论这些结果提示扩增的DNA片段具有启动子活性,而α-Syn作为反式作用因子通过影响TH基因启动子的功能发挥对多巴胺代谢的负性调控作用。     

锇酸固定组织的包埋后免疫电镜胶体金标记方法的改进

目的建立一种适用于中枢神经系统蛋白质抗原定位的包埋后免疫电镜胶体金标记方法。方法利用还原锇酸固定大鼠脑组织切片,首先在冰冻漂浮切片上用NaIO4确定待检抗原的可修复性,然后在亲水树脂Technovit7100包埋的半薄切片寻找使抗原得以最大程度修复的最佳NaIO4浓度,最后在超薄切片上进行相应抗原的免疫胶体金标记。结果NaIO4对不同抗原的修复作用明显不同。对于可修复抗原,低浓度NaIO4即可以使其充分修复。低浓度NaIO4处理组织可使组织超微结构保持完好,并可使胶体金高密度标记。     

GLUT3阳性神经细胞在大鼠脑中的分布及其与脑内葡萄糖监控系统的关系

本文利用抗ＧＬＵＴ３ Ｃ－末端部分合成肽的抗血清对大鼠脑中ＧＬＵＴ３ 阳性神经细胞的分布进行了免疫组织化学研究。结果表明,除在大脑皮层的广泛区域和海马ＣＡ 区存在大量的ＧＬＵＴ３ 阳性神经元外,皮层下的某些核团和区域的神经元以及第三脑室腹侧部的ｔａｎｙｃｙｔｅ 也表达丰富的ＧＬＵＴ３ 蛋白。有趣的是,这些核团的大部分参与构成脑内葡萄糖监控系统的神经网络,有些阳性细胞（如下丘脑外侧区,黑质的神经元和ｔａｎｙｃｙｔｅ ）是这一网络中对血液和脑脊液中葡萄糖浓度发生反应的化学敏感细胞。这一新发现提示ＧＬＵＴ３ 可能与血糖浓度的神经调控有关。     

Deltorphin Ⅰ单克隆抗体的制备及Deltorphin Ⅰ样免疫活性在大鼠脑和培养神经元的表达

Deltorphin(DADT)是由南美洲的一种蛙皮肤中分离出的鸦片样肽,对δ鸦片受体有很高的亲和力和选择性。它是由七个氨基酸构成的小肽,其氨基酸序列为Tyr-D-Ala-Phe-Asp-Val-Val-G1y.NH2。其中,第二位的DAla是其鸦片样活性所必须的。用L-Ala代替D-Ala则其活性消失。已发现大鼠和小鼠脑中含有这种肽的结合位点;向大鼠脑室注射该肽可以引起多种中枢效应,包括局部运动的刺激和记忆巩固等。据此推测脑中很可能存在DADT或其类似物。为证明这种可能性,我们将合成DADT肽在戊二醛存在下结合到BSA上制成抗原免疫Balb/c小鼠,三次加强注射后,…     

帕金森病患者血清对α-突触核蛋白寡聚体形成的促进作用

目的研究帕金森病(PD)患者血清对外源性α-突触核蛋白(α-Synuclein,α-Syn)寡聚体形成的影响,初步分析血清促进α-Syn寡聚体形成的机制。方法将重组人α-Syn加入PD患者和对照组血清中,37℃振荡孵育,用免疫印迹方法鉴定α-Syn寡聚体的形成情况,用ELISA分析α-Syn寡聚体的形成量。结果α-Syn在血清中振荡孵育后主要形成二聚体和十四聚体。与对照组血清相比较,PD患者血清具有促进α-Syn寡聚体形成的作用。在血清中加入还原性谷胱甘肽可明显减弱PD患者血清促进α-Syn寡聚体形成的作用。结论PD患者血清促进α-Syn寡聚体的形成,其机制可能与α-Syn的氧化修饰有关。     

DeltorphinI单克隆抗体的制备及DeltorphinI样免疫活性在在体和离体大鼠脑神经元的表达

本研究利用以BSA上的deltorphinI肽（DAD I）免疫Balb/c小鼠,成功地制备了特异性抗DAD I单克隆抗体。交叉试验表明,所获抗体仅识别DADT I和DADTⅡ而不识别其L型同分异体LADTI,也与其它DADTI类似物无交叉反应。Epitope分析表明,该抗体识别DADTI的N末端特异氨基酸序列,其中包括对其活性有重要影响的第二位的D－Ala-nine。利用这一抗体对成年大鼠脑组织和新生大鼠培养神经元进行了免疫组织化学研究。大鼠脑中有含量较低的DADTI免疫活性,主要分布在某些特定部位的神经纤维和神经元胞体,如终纹床核、杏仁核、海马、伏核、下丘脑外侧区、黑质、中央灰质等部位。然而在培养的大鼠脑神经元,DADTI样免疫活性的含量却很丰富,神经元的胞体和突起均呈较强的DADTI样免疫活性。两项结果均提示哺乳动物脑神经元很可能产生一种与DADTI大结构上极其类似的物质。     

α-突触核蛋白对大脑海马神经元NMDA受体影响的研究

目的 研究α-突触核蛋白(α-Synuclein,α-Syn)对海马神经元N-甲基-D-天门冬氨酸受体(N-methyl-D-aspartate receptors,NMDARs)功能的影响.方法 采用全细胞膜片钳记录模式记录正常培养10～ 12 d左右的海马神经元和经α-Syn处理1h的海马神经元NMDA诱发电流.结果 与正常培养10～12 d左右的海马神经元相比,经α-Syn处理的海马神经元NMDA诱发电流明显减小.结论 α-Syn可减少海马神经元膜上NMDARs数量,并抑制NMDARs活性.