脑卒中患者血浆中α-突触核蛋白及其寡聚体形成量变化的研究

目的 探讨脑卒中患者血浆中α-突触核蛋白（α-synuclein,α-Syn）含量的变化,以及血浆对α-Syn寡聚体形成的影响.方法 收集2012年3月至5月首都医科大学宣武医院神经科诊断为脑卒中的住院患者50例,另收集年龄和性别与之相匹配的30例健康人群为对照组.用ELISA法检测各组人群血浆中的α-Syn总量及寡聚体形成量.结果 脑卒中患者血浆α-Syn总含量及寡聚体形成量较对照组均有显著增加.结论 脑卒中患者血浆中α-Syn含量增高增强其寡聚体的形成.     

帕金森病患者血浆增强α-突触核蛋白寡聚体形成

目的 研究帕金森病（Parkinson＇s disease,PD）患者血浆对α-突触核蛋白（α-synuclein,α-Syn）寡聚体形成的影响.方法 将重组人α-Syn加入PD和对照血浆中,37 ℃振荡孵育144 h,免疫印迹方法鉴定α-Syn寡聚体形成情况,ELISA方法分析α-Syn寡聚体形成的相对质量浓度.结果 α-Syn在 PD患者血浆中形成寡聚体含量明显高于对照组.结论 PD患者血浆可促进α-Syn寡聚体形成.     

α-突触核蛋白和葡糖脑苷脂酶在食蟹猴不同脑区的表达

目的研究α-突触核蛋白(α-synuclein,α-Syn)及葡糖脑苷脂酶(glucocerebrosidase,GCase,GBA)在食蟹猴不同脑区的表达。方法 Western blotting方法及免疫组织化学法检测α-Syn和GBA在食蟹猴纹状体和小脑皮质的表达。酶活性分析法检测GBA活性。免疫荧光双重标记法观察α-Syn和GBA的共定位。结果α-Syn和GBA在胞质和神经末梢中存在共定位。α-Syn、GBA在纹状体和小脑部位均有表达,但α-Syn在纹状体表达量高于小脑,而GBA在纹状体表达量低于小脑。此外,纹状体的GBA酶活性低于小脑。结论不同脑区α-Syn、GBA表达量不同,α-Syn表达量与GBA表达量呈反向关系。     

抑制葡糖脑苷脂酶对多巴胺神经细胞内α-突触核蛋白寡聚体形成及细胞自噬功能的影响

目的 研究抑制葡糖脑苷脂酶（glucocerebrosidase,GBA）活性对多巴胺神经细胞内α-突触核蛋白（α-synuclein,α-Syn）寡聚体形成及自噬功能的影响.方法 在培养MES23.5细胞外添加不同浓度的GBA活性抑制剂（conduritol-β-epoxide,CβE）,观察GBA活性的变化,同时在细胞外添加α-Syn单体使其进入细胞内并孵育48 h.使用双抗体夹心ELISA方法测定细胞内α-Syn寡聚体含量,观察细胞自噬活性、氧化应激和凋亡.结果 随着CβE质量浓度的增加,GBA活性呈质量浓度依赖性的下降,而细胞内α-Syn寡聚体的含量则呈质量浓度依赖性的增加;在CβE处理细胞,随着细胞外添加的α-Syn单体的质量浓度加大,自噬活性和氧化应激液增强,同时细胞凋亡数量增加.结论 抑制GBA活性导致细胞内α-Syn寡聚体增多以及依赖于α-Syn浓度的自噬活性和氧化应激增强和细胞凋亡增加.     

旋毛虫Ts87抗原单克隆抗体的制备及其识别肽段的研究

将原核系统成功表达的Ts87重组蛋白纯化后免疫动物,利用淋巴细胞杂交瘤技术制备抗Ts87抗原的单克隆抗体.通过ElISA、免疫印迹、免疫组化等方法筛选出能分泌抗Ts87御抗原的抗体的阳性克隆,在1000个融合的杂交瘤细胞中,有3株融合细胞分泌的单克隆抗体(2A2,5A3,6G12)鉴定结果为阳性.这3株融合细胞分泌的抗体均能识别Ts87重组蛋白、旋毛虫成虫和幼虫的Ts87抗原以及旋毛虫幼虫组织切片.获得的抗Ts87抗原的单克隆抗体在将来的研究中可作为旋毛虫病的诊断试剂.为了进一步鉴定抗体识别的相应抗原表位和模拟抗原表位,选择了其中一株单克隆抗体5A3筛选噬菌体十二肽库.噬菌体M7展示的肽段是抗体识别Ts87抗原的线性表位,其他的噬菌体克隆展示的肽段是Ts87抗原的模拟表位.该技术为旋毛虫病多表位疫苗的构建奠定了基础.     

α-突触核蛋白在大鼠脊髓的表达

目的研究α-突触核蛋白(α-Synuclein,α-Syn)在正常大鼠脊髓中的表达。方法利用2种抗α-Syn单抗3D5和2E3进行免疫组化染色,观察α-Syn在脊髓的表达和分布;用免疫荧光双标方法观察α-Syn与神经肽Y(NPY)共存的情况。用Luxol fast blue染色鉴别有髓与无髓神经纤维。结果α-Syn主要存在于脊髓灰质神经元核及灰质无髓神经纤维中。富含α-Syn的神经纤维主要分布在脊髓灰质的第Ⅰ、Ⅱ层,而α-Syn核阳性神经元主要分布在第Ⅶ、Ⅷ、Ⅸ、Ⅹ层;后根第Ⅰ、Ⅱ层一小部分α-Syn阳性纤维与NPY共存;前角细胞核呈α-Syn阳性神经元胞质中存在NPY,而其他部位的α-Syn核阳性神经元胞质中无NPY。结论α-Syn存在于大鼠脊髓灰质的神经元核及无髓神经纤维中,部分阳性神经纤维和神经元胞体呈NPY免疫阳性反应。     

帕金森病患者血清低分子量蛋白质差异表达分析

目的探讨帕金森病(Parkinson’s disease,PD)患者区别于正常人的血清蛋白质差异表达。方法选择原发性PD患者35例和正常人35例,用弱阳离子交换(weak cationic exchange,WCX)磁珠捕获血清蛋白质组分,用MALDI-TOF-MS(matrix assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometer)检测各样品的蛋白质质谱,统计学筛选差异表达分子,监督神经网络算法建立区分模型,盲法验证。结果在PD组和对照组之间筛查到8个差异分子(非参数检验Z值范围为-4.458～-3.059,P<0.05)。以监督神经网络算法建立区分模型,其判断正确率为81.4%。对25例新样本的盲法验证结果显示,模型的正确率为76.0%。结论PD患者血清蛋白质的表达谱有别于正常人。蛋白质组学数据结合生物信息学方法可能有助于PD的诊断。     

大鼠不同脑区线粒体中α-突触核蛋白含量与各种氧化和抗氧化指标的关系

目的分析大鼠不同脑区线粒体中α-突触核蛋白(α-synuclein,α-SYN)含量与氧化应激水平及其相互关系,探讨帕金森病(Parkinson’s disease,PD)选择性损伤神经元的原因。方法采用Percoll密度梯度离心法提取脑组织线粒体、Western blotting法和ELISA法测定线粒体中α-SYN含量;通过检测脑组织主要氧化指标丙二醛(malonaldehyde,MDA)和抗氧化指标总抗氧化能力(total anti-oxidation capability,T-AOC)、谷胱甘肽(glutathione,GSH)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-PX)和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)的含量判定氧化应激水平。结果不同脑区线粒体中的α-SYN含量不同,其中,PD易损区纹状体、海马与嗅球中的线粒体中α-SYN的含量较高,而PD非易损区额叶皮质和小脑中的线粒体中α-SYN含量较低,易损区与非易损区线粒体中的α-SYN含量的差异有统计学意义。不同脑区各种氧化和抗氧化指标应有所不同,但差异无统计学意义,与线粒体中的α-SYN含量没有明显关系。结论不同脑区线粒体中α-SYN含量不同,但与氧化应激水平无相关性。     

突变型α突触核蛋白对大鼠皮质神经元原代培养存活率的影响

目的观察α-突触核蛋白(α-Syn)和其家族性突变型A30P和A53T对大鼠皮质神经元原代培养存活率的影响。方法取大鼠前脑皮质神经元进行分组培养。在培养基中添加α-Syn和其突变体A30P、A53T,培养至1 h、2 h和4 h进行观察,比较A30P、A53T与α-Syn对原代培养神经元生长的影响。神经元以成像显微镜观察并计数,Western印迹法、免疫荧光法、单克隆抗体阻断实验鉴定各蛋白作用的特异性。结果添加α-Syn组的神经元培养至1 h、2 h和4 h时,其神经元的平均存活率大于对照组和添加A30P、A53T组(P<0.05)。A30P组和A53T组的神经元存平均活率与对照组无差异(P>0.05)。增加蛋白的浓度,α-Syn组神经元存活率与添加A30P和A53T组差异越大(P<0.01)。western blot和免疫荧光实验证实α-Syn可由培养基进入到神经元内,而A30P和A53T不能进入神经元。结论α-Syn在大鼠皮质原代神经元培养初期对其存活率具有促进作用,而其突变体A30P和A53T无这一作用,这一现象与其发生家族性突变有关,并可能成为导致PD发病原因之一。     

α-突触核蛋白调控大鼠线粒体复合体I活性

目的研究α-突触核蛋白（α-SYN）在大鼠不同脑区线粒体的表达及对线粒体呼吸链复合体I活性的影响。方法用免疫印迹方法检测不同脑区线粒体中α—SYN表达量的变化并测定α-SYN向分离线粒体的转运；通过观察340nm处NADH吸收值的变化测定线粒体呼吸链复合体I的活性。结果线粒体α-SYN在不同脑区的表达量不同。人重组α-SYN与分离线粒体进行孵育后，以剂量依赖的方式转运到线粒体内。将不同浓度人重组α-SYN与线粒体孵育后，线粒体复合体I活性下降，并且呈明显的量．效关系。结论线粒体α-SYN在不同脑区的表达量不同。线粒体的α—SYN有可能来源于胞质α-SYN向线粒体的转运，并调节复合体I的活性。