构建内皮型一氧化氮合酶真核表达载体及在内皮细胞的表达

背景：内皮型一氧化氮合酶表达产物对内皮细胞的影响是血管外科基础研究中的重要课题，对于生物人工血管的研制有重要意义。 目的：构建内皮型一氧化氮合酶基因真核表达载体pcDNA3.1/eNOS，以脂质体为介导观察其在血管内皮细胞中的转染效率，评价表达产物内皮型一氧化氮合酶的酶学活性及其对内皮细胞生长的影响。 设计、时间及地点：单一样本观察，实验于2005-07/2007-05在南京大学医学院附属鼓楼医院生物化学实验室完成。 材料：质粒PCMV-eNOS由勋阳医学院张群林教授惠赠。pcDNA3.1真核表达载体由南京大学博士后贾立军馈赠，pcDNA3.0/EGFP质粒由戚金亮博士提供。大肠杆菌DH5a和人脐静脉内皮细胞株(ECV304)为南京大学生物系保存。 方法：采用分子生物学技术，先用限制性核酸内切酶EcorⅠ酶切质粒PCMV/eNOS,电泳回收3.6 kb编码人内皮型一氧化氮合酶cDNA序列，克隆入质粒pcDNA3.1的EcorⅠ酶切位点，通过内皮型一氧化氮合酶cDNA序列中的XhoⅠ酶切位点筛选其插入载体的方向，构建pcDNA3.1/eNOS重组质粒。以Lipofec-tamine为介导将其与pcDNA3.0/EGFP共转染分离培养的人脐静脉内皮细胞(ECV304)。 主要观察指标：①观察转染后对ECV304生长的影响，在流式细胞仪和荧光显微镜下计算转染效率。②以反转录-聚合酶链反应和免疫组织化学检测内皮型一氧化氮合酶基因的表达，测定内皮型一氧化氮合酶活性以及一氧化氮产量。③观察施加不同因素（L-精氨酸、氯化钙、乙二胺四乙酸、L-NAME）对内皮型一氧化氮合酶活性及一氧化氮合成的影响；同时检测此时ECV304生长所受影响。 结果：以脂质体为介导转染人脐静脉ECV304后，其转染效率为(32.6±2.6)%，反转录-聚合酶链反应和免疫组织化学检测到相应的内皮型一氧化氮合酶mRNA和蛋白表达，与对照组有明显差别；同时在上述不同因素影响下内皮型一氧化氮合酶活性出现明显差别；随着培养液一氧化氮浓度升高，ECV304生长曲线下降。 结论：成功构建pcDNA3.1/eNOS，在脂质体介导下能高效转染ECV304并良好表达，Ca2+是内皮型一氧化氮合酶的必要激活条件，ECV304的增生受到高浓度一氧化氮抑制。     

自拟健胃消食汤治疗小儿厌食症126例临床观察

目的：分析自拟健脾消食汤治疗小儿厌食症的临床疗效。方法选取224例厌食症患儿，随机分为2组，观察组(126例)口服自拟的健脾消食汤，对照组(98例)口服葡萄糖酸锌口服液或健胃消食片，观察2组疗效。结果观察组总有效率98.41％，显著高于对照组的92.86%，差异具有统计学意义(P＜0.05)；2组不良反应差异无统计学意义。结论自拟健脾消食汤具有健脾开胃、增进食欲、增强消化吸收的功能，治疗小儿厌食症安全、有效，经济实用，值得临床推广应用。     

脱细胞支架复合犬骨髓源内皮祖细胞构建组织工程血管

背景：目前临床使用的小口径（〈6cm）人工血管因生物相容性差、远期通畅率低，效果并不理想。 目的：将犬骨髓源内皮祖细胞与脱细胞血管支架动态复合培养，尝试构建一种全新的组织工程血管代用品。 设计、时间及地点：随机对照实验，细胞学、组织病理学体外观察，于2005—12／2007-12在南京大学医学院附属鼓楼医院实验室完成。 材料：通过去污剂-酶消化法制备犬颈动脉脱细胞支架；采用密度梯度离心法和内皮系条件培养法，分离扩增犬骨髓源内皮祖细胞，将扩增后的内皮祖细胞种植于脱细胞支架并置于生物反应器中动态构建组织工程血管。 方法：20只犬均暴露两侧颈总动脉及一侧股动脉，每只犬在3段血管随机移植组织工程血管、脱细胞血管支架及自体静脉，分别为组织工程血管组、脱细胞血管支架组及自体静脉组，每组的移植血管数量均为20例。 主要观察指标：对培养的内皮祖细胞进行免疫组化鉴定；血管移植术后6个月行数字减影血管造影、病理切片、扫描电镜等观察移植效果。 结果：犬骨髓单个核细胞在体外培养10d后形成“铺路石样”细胞，免疫组化结果符合内皮祖细胞表型特征；将内皮祖细胞与脱细胞支架置于生物反应器培养10d后，种子细胞在血管腔内黏附生长；犬动脉移植术6个月后，组织工程血管及白体静脉通畅率分别为85％，90％，均优于脱细胞支架移植组25％。 结论：犬骨髓源内皮祖细胞复合脱细胞血管支架，可获得一种具有良好生物相容性和通畅率的生物人工血管。     

利伐沙班在下肢深静脉血栓溶栓治疗中的应用效果分析

目的 探究利伐沙班在下肢深静脉血栓（DVT）溶栓治疗中的抗凝效果及安全性。方法 收集2021年1月至2021年12月于江苏省中医院接受治疗的71例下肢DVT患者的临床资料。比较两组患者的抗凝治疗效果、治疗前后的下肢周径差及患肢静脉血流速度、血清因子水平及用药阶段抗凝药物相关不良反应的发生情况。结果 观察组患者的抗凝治疗有效率高于对照组患者,差异有统计学意义（P<0.05）。治疗后,观察组患者的下肢周径差低于对照组患者,患肢静脉血流速度高于对照组患者,差异均有统计学意义（P<0.05）。治疗后,观察组患者的D-D水平低于对照组患者,PT、APTT均短于对照组患者,差异均有统计学意义（P<0.05）。观察组患者抗凝药物相关不良反应的发生率低于对照组患者,差异有统计学意义（P<0.05）。结论 利伐沙班用于下肢DVT的溶栓治疗,不仅可确保获得良好的抗凝效果,还可避免凝血功能指标的异常波动,减少不良反应。     

小檗 碱联合西洛他唑治疗下肢动脉硬化闭塞症的疗效及机制

目的 观察小檗碱联合西洛他唑治疗下肢动脉硬化闭塞症(ASO)患者的临床疗效,并探讨其可能的机制.方法 采取前瞻性随机对照研究方法,选取2015年5月至2017年5月江苏省中医院诊断明确的间歇性跛行期下肢ASO患者30例纳入研究,随机分为治疗组和对照组,每组15例.对照组接受西洛他唑口服(100 mg/次,2次/d)治疗...     

从异病同治论小儿便秘与泄泻的辩证相关性

目的 探讨异病同治原则在治疗小儿便秘和泄泻中的应用.方法 对53例腹泻患儿和28例便秘患儿在明确其证型相同后,均采取口服益生菌和补中益气丸的相同方法治疗,观察临床疗效.结果 2个疗程后,腹泻和便秘患儿的平均症状评分分别由原来的(2.13±0.62)分和(2.34±0.54)分,下降为(0.31±0.17)分和(0.22±0.13)分,与治疗前比较,差异均有统计学意义(P<0.05).腹泻和便秘患儿总有效率分别达到98.11%和96.43%,差异无统计学意义.服用前后所有患儿的精神、心率、血压均无明显变化,治疗期间未出现任何与药物相关的不良反应.结论 治疗小儿便秘和泄泻应该坚持辨证与辨病相结合,采取同证同治、异病同治同样能取得较好的治疗效果.     

人外周血内皮祖细胞的分离、培养及鉴定

背景：内皮祖细胞是成熟内皮细胞的前体细胞,具有新生血管和新生内皮化作用,在许多方面均有广泛应用前景,但其生物学特征及鉴定方法仍存争议。目的：探索从人外周血分离培养内皮祖细胞的方法并鉴定其生物学特征。方法：外周采血后应用密度梯度离心法分离成人外周血单核细胞,在内皮细胞全培养基重悬后接种于纤维连接蛋白包被的培养瓶中,体外培养扩增获取人内皮祖细胞并观察其形态变化、生长增殖潜能及细胞表面抗原表达情况,并通过细胞一氧化氮分泌功能测定及体外血管形成实验检测其功能学特征。结果与结论：体外诱导培养后,六七天形成纺锤样细胞簇,两三周黏附细胞发育形成鹅卵石样外观细胞,逐渐融合呈外生性生长。在相同培养条件下,与人主动脉内皮细胞相比人内皮祖细胞具有高的增殖潜能。人内皮祖细胞表达CD31、CD34、CD144、KDR,表现为典型内皮细胞系表型,此外细胞可摄取ac-LDL并结合UEA-I。在功能上内皮祖细胞可分泌一氧化氮并可在Matrigel中形成管腔样结构。提示通过密度梯度离心法分离人外周血单核细胞体外黏附诱导培养可获取人外周血内皮祖细胞;细胞形态、增殖能力、生物表型特征结合细胞功能学的综合性鉴定方法用于内皮祖细胞的鉴定具有一定意义。     

构建内皮型一氧化氮合酶真核表达载体及在内皮细胞的表达

背景:内皮型一氧化氮合酶表达产物对内皮细胞的影响是血管外科基础研究中的重要课题,对于生物人工血管的研制有重要意义。目的:构建内皮型一氧化氮合酶基因真核表达载体pcDNA3.1/eNOS,以脂质体为介导观察其在血管内皮细胞中的转染效率,评价表达产物内皮型一氧化氮合酶的酶学活性及其对内皮细胞生长的影响。设计、时间及地点:单一样本观察,实验于2005-07/2007-05在南京大学医学院附属鼓楼医院生物化学实验室完成。材料:质粒PCMV-eNOS由勋阳医学院张群林教授惠赠。pcDNA3.1真核表达载体由南京大学博士后贾立军馈赠,pcDNA3.0/EGFP质粒由戚金亮博士提供。大肠杆菌DH5a和人脐静脉内皮细胞株(ECV304)为南京大学生物系保存。方法:采用分子生物学技术,先用限制性核酸内切酶EcorⅠ酶切质粒PCMV/eNOS,电泳回收3.6kb编码人内皮型一氧化氮合酶cDNA序列,克隆入质粒pcDNA3.1的EcorⅠ酶切位点,通过内皮型一氧化氮合酶cDNA序列中的XhoⅠ酶切位点筛选其插入载体的方向,构建pcDNA3.1/eNOS重组质粒。以Lipofec-tamine为介导将其与pcDNA3.0/EGFP共转染分离培养的人脐静脉内皮细胞(ECV304)。主要观察指标:①观察转染后对ECV304生长的影响,在流式细胞仪和荧光显微镜下计算转染效率。②以反转录-聚合酶链反应和免疫组织化学检测内皮型一氧化氮合酶基因的表达,测定内皮型一氧化氮合酶活性以及一氧化氮产量。③观察施加不同因素(L-精氨酸、氯化钙、乙二胺四乙酸、L-NAME)对内皮型一氧化氮合酶活性及一氧化氮合成的影响;同时检测此时ECV304生长所受影响。结果:以脂质体为介导转染人脐静脉ECV304后,其转染效率为(32.6±2.6)%,反转录-聚合酶链反应和免疫组织化学检测到相应的内皮型一氧化氮合酶mRNA和蛋白表达,与对照组有明显差别;同时在上述不同因素影响下内皮型一氧化氮合酶活性出现明显差别;随着培养液一氧化氮浓度升高,ECV304生长曲线下降。结论:成功构建pcDNA3.1/eNOS,在脂质体介导下能高效转染ECV304并良好表达,Ca2 是内皮型一氧化氮合酶的必要激活条件,ECV304的增生受到高浓度一氧化氮抑制。