基于幽门螺杆菌UreB优势抗原表位多抗原肽疫苗制备及其免疫保护作用

目的 构建串联式幽门螺杆菌UreB抗原优势表位UreB322和UreB527原核重组表达系统,制备UreB322和UreB527表位与多肽载体Poly-Asp-Lys的多抗原肽(MAP)疫苗并确定其免疫原性和免疫保护性.方法 采用连接引物PCR构建含肠激酶(EK)位点的串联式UreB322和UreB527表位基因及其原核表达系统.表达的目的重组融合蛋白8×[rEK-UreB322-EK-UreB527-EK]经EK水解后用Sephadex G-25柱分离rUreB322-EK和rUreB527-EK片段.采用碳二亚胺法将rUreB322-EK、rUreB527-EK与Poly-Asp-Lys载体分子交联,制备出多抗原肽疫苗MAP-rUreB322/B527.采用ELISA和Western blot分别检测各重组表位肽及MAP-rUreB322/527的抗原性和免疫反应性.采用幽门螺杆菌SS1株感染BALB/c小鼠模型检测MAP-rUreB322/527免疫保护效果.结果 获得了8次重复串联的UreB322和UreB527编码基因及其原核表达系统,目的融合蛋白8×[rEKUreB322-EK-rUreB527-EK]表达量可达细菌总蛋白的48％.肠激酶可将目的融合蛋白完全水解为rUreB322-EK和rUreB527-EK片段.rUreB322-EK和rUreB527-EK与Poly-Asp-Lys交联率高达92.5％.幽门螺杆菌全菌抗体及rUreB-IgG均能识别rUreB322-EK、rUreB527-EK和MAP-rUmB322/527并与之结合.MAP-rUreB322/527免疫小鼠血清抗体水平明显高于rUreB(P＜0.05).50或100μgMAP-rUreB322/527对幽门螺杆菌SS1株感染小鼠的保护率(83.3％和91.7％)明显高于等量rUreB(41.7％和50.0％)(P＜0.05).结论 本研究成功地构建了幽门螺杆菌UreB抗原优势表位UreB322和UreB527重复串联式编码基因及其原核表达系统,基于UreB优势抗原表位的多抗原肽疫苗MAPrUreB322/527能显著提高免疫保护效果.     

杭州地区伤寒及甲型副伤寒沙门菌流行菌株分子特征的研究

目的 了解并确定2002-2008年杭州地区伤寒沙门菌、甲型副伤寒沙门菌优势菌株的分子特征.方法 采用脉冲场凝胶电泳(PFGE)、多位点串联重复序列分析(MLVA)或多位点序列分型(MLST)对2002-2008年杭州地区分离的31株伤寒沙门菌、404株甲型副伤寒沙门菌进行分型并分析.结果 404株甲型副伤寒沙门菌可分为6个PFGE型,P1型和P2型属于同一个克隆系,99.0％ (400/404)菌株属于该克隆系,其中P1型菌株占该克隆系菌株的93.3％ (373/400).31株伤寒沙门菌株存在高度多样性,可分为14个PFGE型、28个MLVA型(分辨率90.3％)、3个MIST型.根据MLVA各型靶位点多态性差异,本地区流行的伤寒沙门菌株与东南亚地区菌株相近,但与欧洲菌株差距较大,呈高度多态性的可变串联重复序列(VNTR)位点TR1、TR2、Sal02可作为本地区伤寒沙门菌株的检测标志.伤寒沙门菌株MLST型别包括了目前国际上发现的所有3个型别,但以ST2型为主(23/31,74.2％).结论 近年杭州地区甲型副伤寒疫情由同一亚系菌株感染所致,但本地区流行的伤寒沙门菌株呈现高度多样性.     

钩端螺旋体毒性蛋白VapC核酸酶活性及其对宿主细胞毒性作用的研究

目的 了解钩端螺旋体毒素-抗毒素系统中毒性蛋白VapC的功能及其对宿主细胞的毒性作用.方法 以致病性问号钩体黄疸出血群赖型赖株基因组DNA为模板,采用PCR扩增全长vapB、vapC、vapBC基因并构建其原核表达系统.采用SDS-PAGE检测目的重组蛋白rVapB和rVapC 表达情况,Ni-NTA亲和层析柱提纯rVapB和rVapC.检测rVapB和rVapC有无水解问号钩体赖株及THP-1细胞DNA或RNA活性.分别采用实时荧光定量PCR和Western blot试验,检测问号钩体赖株感染THP-1细胞前后vapB和vapC基因转录及表达水平的变化.构建vapB和vapC基因真核表达载体并转染细胞,采用CCK-8试剂检测VapB和VapC蛋白对细胞活性的影响.结果 所克隆的vapB和vapC基因核苷酸及氨基酸序列与文献报道完全相同.所构建的原核表达系统能分别表达rVapB 和rVapC.rVapC可水解RNA,但不水解DNA.问号钩体赖株感染THP-1细胞后,vapB和vapC基因 转录及表达水平均显著上调,部分毒性蛋白VapC外分泌.转染vapC基因的人肾小管上皮细胞HEK293大量死亡.结论 问号钩体赖株VapC蛋白为RNA酶,可在感染宿主细胞过程中外分泌并对细胞有明显毒性.     

快速检测结核分枝杆菌异烟肼和利福平耐药相关基因mPCR-SSCP建立及应用

目的 建立快速检测结核分枝杆菌异烟肼(INH)和利福平(RFP)耐药相关基因katG、inhA和rpoB突变的多重聚合酶链反应-单链构象多态性(multi PCR-single strand conformational polymorphism analysis,mPCR-SSCP)方法.方法 药敏试验检测134株结核分枝杆菌临床菌株对INH和RFP的耐药性.设计结核分枝杆菌INH和RFP耐药相关katG、inhA和rpoB基因PCR引物,建立mPCR-SSCP技术检测上述菌株katG、inhA和rpoB基因的突变,同时采用PCR直接测序技术(PCR-DS)检测上述基因片段突变情况,并对上述3种方法检测结果进行分析和比较.结果 134株临床菌株均含有katG、inhA和rpoB基因,其中42株(31.3％)对INH耐药、45株(33.6％)对RFP耐药.mPCR-SSCP和PCR-DS检测结果显示,92株INH敏感菌株katG和inhA基因均未发生突变,检测特异性均为100％;89株RFP敏感菌株中rpoB基因分别有2株和1株检测出突变,检测特异性分别为97.8％和98.9％;42株INH耐药菌株中分别有33株和36株katG和/或inhA基因突变,检测灵敏度分别为78.6％和85.7％;45株RFP耐药菌株中rpoB基因分别有41株和43株发生突变,检测灵敏度分别为91.1％和95.6％.结论 本研究建立的mPCR-SSCP能快速、简便、特异,并有一定的敏感性检测结核分枝杆菌异烟肼和利福平耐药相关基因katG、inhA和rpoB突变,具有临床应用前景.     

经皮加压钢板系统和倒置微创内固定系统置入治疗老年股骨转子间骨折的半年随访

背景：近年来以股骨近端髓内钉、防旋股骨近端髓内钉为代表的髓内固定系统治疗股骨转子间骨折报道较多,但两者比较分析的研究较少。目的：探讨经皮加压钢板和倒置微创内固定两种治疗股骨转子间骨折的临床效果。方法：经皮加压钢板置入21例,倒置微创系统置入15例,年龄65~91岁。观察置入后并发症及髋关节功能Harris评分。结果与结论：全部获得随访6个月,髋关节功能经皮加压钢板组优良率87%,倒置微创内固定组87%。两组患者并发症少,没有患者发生钢板螺钉松动断裂、深静脉血栓形成、髋内翻。提示对于使用髓内固定系统有困难的老年股骨转子间骨折,用此两种微创髓外固定系统也可达到理想的治疗效果。     

问号钩端螺旋体在体外诱导细胞凋亡及相关信号通路的研究

目的 了解问号钩端螺旋体诱导不同宿主细胞凋亡的作用及相关胞内信号传导通路.方法 建立问号钩体黄疸出血群赖型赖株小鼠单核-巨噬样细胞J774A.1、人脐静脉内皮细胞EVC304和人Ⅱ型肺泡上皮细胞A549感染模型.采用FITC-Annexin V/PI荧光标记流式细胞术检测细胞凋亡或坏死情况.分别采用荧光比色法和Western blot检测感染的J774A.1细胞caspase-3,-8,-9活性和凋亡相关蛋白FADD(Fas-associated death domain)表达水平.结果 问号钩体赖株感染1～6 h后,36.70%～63.70%的J774A.1细胞可H{现明显的早期凋亡,感染12 h时转变为晚期凋亡或坏死为主(53.68%).78.52%问号钩体赖株感染的A549细胞仪出现晚期凋亡或坏死.问号钩体赖株感染的EVC304细胞无细胞凋亡或坏死现象.感染的J774A.1细胞caspase-3和-8最大活性分别为(1453.41±36.07)和(1402.15±59.09)Fu,是未感染细胞的16.38和29.99倍.感染的J774A.1细胞caspase-9虽略有升高为(89.42±5.08)Fu,但明显低于caspase-3和-8(P<0.001).随着感染时间的延长,感染的J774A.1细胞FADD蛋白表达量逐步增加.结论 问号钩体诱导宿主细胞凋亡的效应町因细胞种类不同而有明显差异,FADD→caspase-8→caspase-3是介导问号钩体感染J774A.1细胞凋亡的主要信号通路.     

钩端螺旋体属特异性外膜蛋白抗原的分析

致病性问号钩端螺旋体(简称钩体)血清群众多,各群间交叉保护作用较弱或无,目前国内外均采用当地流行的钩体血清群来制备多价钩体疫苗,但对疫苗中未包含钩体血清群感染的保护作用极其有限,易造成钩体病的暴发流行。已知80℃灭活、生理盐水回收的腐生性双曲钩体PatocⅠ株全细胞抗原(TR PatocⅠ)能与所有钩体病人血清发生凝集反应,但其抗血清能否凝集不同血清群的问号钩端螺旋体尚不清楚。本研究中,我们采用TR PatocⅠ免疫的兔抗血清与我国15群17型问号钩体参考标准株、2群2型双曲钩体国际标准株进行了显微镜凝集试验(MAT) ,发现该抗血清能…     

葡萄球菌肠毒素A基因原核表达系统的构建及其表达产物的鉴定

 目的：构建葡萄球菌肠毒素A（SEA）基因原核表达系统，了解重组表达产物rSEA促淋巴细胞增殖和抑制肿瘤生长的作用。方法：采用高保真PCR从金黄色葡萄球菌ATCC13565株DNA中扩增全长SEA基因片段，T-A克隆后测序，构建SEA基因原核表达系统pET32a-SEA-E.coliBL21DE3。采用SDS-PAGE检测rSEA表达量，Ni-NTA亲和层析法提纯rSEA。采用TCID₅₀法测定rSEA对Vero细胞的细胞毒性并计算TCIC₅₀值。采用MTT比色法分别检测不同浓度rSEA体外对小鼠脾细胞、人外周血单个核细胞（PBMC）的促增殖作用以及对HepG2细胞（人肝癌细胞）、HeLa细胞（人宫颈癌上皮细胞）的生长抑制作用。结果: 与公布的相关序列比较，所克隆的SEA基因核苷酸序列相似性为100%。rSEA表达量约为细菌总蛋白的25%。rSEA对Vero细胞的TCIC₅₀为3.14 μg。1.0-20.0 mg/L的rSEA对小鼠脾细胞和人PBMC均有明显的促增殖作用（P<0.05）。5.0-20.0 mg/L rSEA作用的人PBMC上清均能有效地抑制HepG2细胞和HeLa细胞生长（P<0.05）。结论:成功地构建了rSEA原核表达系统。rSEA仍然具有生物学活性。所建立的细胞毒性、促淋巴细胞增殖和抑制肿瘤细胞生长作用的检测方法，为以后减毒rSEA突变体的筛选奠定了基础。     

问号钩端螺旋体rLTB/rCTB-LipL32/1免疫保护作用及野生株LipL32基因表达和患者抗体检测

目的构建LTB—LipL32／1和CTB—LipL32／1融合基因原核表达系统并鉴定其表达产物的免疫和佐剂活性及保护作用，了解问号钩端螺旋体(简称钩体)野生株LipL32基因携带、表达及钩体病人血清LipL32基因产物抗体产生频率。方法采用常规分子生物学技术构建LTB—LipL32／1和CTB—LipL32／1融合基因及其原核表达系统。采用SDS-PAGE检测目的重组蛋白rLTB-LipL32／1及rCTB-LipL32／1表达情况。分别采用Western blot和GM1-ELISA检测rLTB-LipL32／1及rCTB—LipL32／1的免疫反应性和佐剂活性。采用PCR和MAT分别检测97株问号钩体野生株LipL32基因及其表达情况。采用ELISA检测228例钩体病人血清LipL32基因产物的抗体。采用豚鼠保护试验检测重组蛋白的免疫保护作用。结果与报道的相关序列比较，LTB—LipL32／1和CTB-LipL32／1融合基因核苷酸序列相似性分别为99．12％～99．71％和98．54％～99．42％，氨基酸序列相似性分别为97．58％-99．63％和96．77％～99．63％。rLTB-LipL32／1和rCTB—LipL32／1表达产量均约为细菌总蛋白的10％，并主要以包涵体形式存在。rLTB—LipL32／1和rCTB-LipL32／1均分别能与LipL32／1兔抗血清和牛GMI结合。97．9％(95／97)问号钩体野生株含有LipL32基因，95．9％(93／97)问号钩体野生株与rLipL32／1和rLipL32／2兔抗血清的MAT结果阳性。97．4％(222／228)和94．7％(216／228)的病人血清rLipL32／1和rLipL32／2抗体阳性。rLTB-LipL32／1、rCTB-LipL32／1和rLipL32／1豚鼠保护率分别为75．0％、75．0％～87．5％、50．O％～62．5％。结论成功构建了LTB—LipL32／1和CTB—LipL32／1融合基因及其原核表达系统。rLTB-LipL32／1和rCTB-LipL32／1融合蛋白有良好的抗原性和佐剂活性及一定的免疫保护作用，具有成为问号钩体属特异性疫苗的良好前景。LipL32／1是不同问号钩体血清群中广泛存在、序列保守、高频率表达的基因。     

牙龈卟啉单胞菌临床菌株fimA基因变异性和表达频率及其重组表达产物的致炎作用

目的了解牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas gingivalis，Pg）归以基因变异性，构建归以基因原核表达系统，鉴定其表达产物（rFimA）的致炎作用，检测FimA在咯临床菌株中表达频率，了解FimA与慢性牙周炎的关系。方法采用高保真PCR从6株咯临床菌株中扩增fimA基因并测定其核苷酸序列。构建fimA基因原核表达系统，制备rFimA兔抗血清。采用Western blot鉴定rFimA抗原性和免疫反应性。建立ELISA检测38株段临床菌株FimA表达情况和97例慢性牙周炎患者212份龈下菌斑标本中的FimA。检测rFimA诱导人脐静脉内皮EVC-304细胞分泌n1、IL-8、TNF-α和细胞问黏附分子-1（ICAM-1）的作用。结果6株Pg临床菌株fimA基因核苷酸序列完全相同。所构建的原核表达系统rFimA产量高达细菌总蛋白的50％左右。rFimA可与Pg全菌抗血清发生结合反应，免疫家兔可获得高效价抗体。94．7％（36／3S）菌株和91．5％（194／212）龈下菌斑标本ELISA结果阳性。1和10μg的rFimA作用EVC-304细胞48h，其分泌的IL-1α水平升高（P〈0．05）；但作用12h即可出现高水平的ICAM-1（P〈0．05），未发现有诱导IL-8和TNF-α的作用（P〉0．05）。结论 fimA基因序列保守，在Pg临床菌株中有很高的表达频率。rFimA有良好的抗原性和免疫反应性，可作为Pg血清学检测试剂盒和段疫苗的候选抗原。rFimA有较强的诱导细胞分泌ICAM-1的作用。