2种SARS冠状病毒分子生物学快速检测方法的建立

目的建立SARS冠状病毒NS、S基因的检测方法,为青岛市可能出现的SARS病毒流行提供一个标准的、可以确证为SARS病毒感染的实验室检测方法。方法分别根据SARS-CoVnsp11基因和S基因片段序列,建立了2种SARS-CoV基因检测方法,并对2003年4月20日～2003年9月20日期间收集的106份青岛市部分医院呼吸道门诊急性呼吸道感染者的血清样品进行了检测。结果106份急性呼吸道感染标本和健康对照人群的SARNS、S基因RT-PCR检测均为阴性。结论建立的2种SARS-CoV核酸RT-PCR检测的方法具有较高的特异性,可用于SARS感染的实验室检测。同期急性呼吸道感染人群中未发现SARS感染病例。     

子宫肿瘤HPV16/18DNA感染与TNF表达的相关性研究

目的 :探讨子宫肿瘤人乳头瘤 (HPV) 16/ 18DNA病毒感染与TNF表达是否存在相关性。方法 :分别应用非同位素原位杂交技术及免疫组化方法选择性对 3个传代的细胞系及 96例宫颈标本和75例子宫内膜标本进行了HPV16/ 18DNA感染及TNF表达的研究。结果 :SiHa、W 12细胞系HPV16/18DNA感染为阳性 ,NCx细胞系为阴性 ;正常宫颈组织、CINⅠ、CINⅢ、宫颈鳞癌阳性表达分别为 2例、5例、9例、2 7例 ,四组差异有极显著性 (P <0 .0 1) ;正常子宫内膜组织均为阴性 ,子宫内膜癌阳性表达 10例。正常宫颈组织、正常内膜组织TNF蛋白、TNFmRNA均未有阳性表达。宫颈癌 2 5例 ,子宫内膜癌 13例TNF蛋白为阳性 ,宫颈癌 2 2例 ,子宫内膜癌 16例TNFmRNA为阳性。宫颈癌HPV16/ 18感染与TNF蛋白表达两者均为阳性的为 2 2例 ;HPV16/ 18阴性、TNF蛋白阳性的 3例 ;子宫内膜癌两者均阳性的为 8例 ;HPV16/ 18阴性、TNF蛋白阳性的 5例。结论 :HPV16/ 18阳性者TNF蛋白表达明显高于阴性者 ,以宫颈鳞癌最为显著 (P <0 .0 1)。     

3种检测泌尿生殖道沙眼衣原体方法的比较

①目的比较3种泌尿生殖道沙眼衣原体实验室检测方法的敏感度和特异度。②方法用细胞培养法、酶联免疫吸附测定(ELISA)法和聚合酶链反应(PCR)结合反向杂交技术,分别对201例非淋菌泌尿生殖道炎症病人的尿道(男性)或宫颈拭子(女性)以及血清标本进行检测,对3种方法的检测结果进行比较。③结果细胞培养法检测出阳性标本49例(24.38%),ELISA法检测出阳性标本38例(18.91%),PCR结合反向杂交技术检测出阳性标本51例(25.37%)。以细胞培养法检测结果为金标准,PCR结合反向杂交技术的敏感度和特异度分别为100.00%和98.68%;ELISA法则为73.47%和98.68%。PCR结合反向杂交技术和细胞培养法检测结果无显著性差异(χ2=0.50,P>0.05),两者与ELISA法检测结果比较均有显著性差异(2χ=8.47、6.67,P<0.05)。④结论PCR结合反向杂交技术具有较高的敏感度和特异度,可以用于临床检验。     

SELDI技术分析体外培养不同肝细胞株差异蛋白的表达

目的: 运用表面增强激光解吸/离子化/飞行时间质谱(SELDI-TOF-MS) 技术,检测体外培养的肝癌细胞株(HepG2),转染乙肝病毒的肝癌细胞株(HepG2.2.15)与正常肝细胞株(LO2)蛋白质的差异表达,筛选肝细胞癌的标志蛋白,为进一步研究肝癌发病的蛋白质组学机制奠定基础. 方法: 常规培养上述3种细胞,细胞状态良好时收集细胞,裂解细胞后采用 SELDI-TOF-MS技术用WCX2芯片检测HepG2, HepG2.2.15, LO2细胞内蛋白质组学的差异表达. 结果: WCX2芯片共捕获91个蛋白,在Mr 5000～15 000区段,与正常肝细胞株比较,有7个蛋白质在两种肝癌细胞中出现明显变化,其中2个蛋白在肝癌细胞中表达量增高,5个蛋白在肝癌细胞中表达量降低;另外两种肝癌细胞株也有其各自的标志蛋白,9个蛋白分子在HepG2表达量增高,10个蛋白分子在HepG2.2.15表达量增高. 结论: SELDI蛋白芯片技术检测可作为检测肝癌早期生物标记的方法,它简便,敏感性高,重复性好,本文发现的这些组织特异性蛋白生物标记对肝癌的早期诊断有潜在的应用价值,对我们从血清或组织标本中筛选和鉴定不同型别肝癌细胞之间的标志蛋白有重要意义,从而为从蛋白质水平研究肝癌的发病机制及新的治疗靶位的寻找奠定了一定的基础.     

IL-12修饰的生孢梭菌抗小鼠乳腺癌作用观察

目的基于实体瘤内部普遍存在缺氧区及生孢梭菌厌氧生长的特性,利用生孢梭菌靶向递送IL-12至肿瘤部位,观察其抗肿瘤效果及其毒副作用。方法利用基因工程技术将IL-12cDNA克隆至大肠埃希菌-厌氧菌穿梭质粒pIMP1并转入生孢梭菌。用ELISA和Western blot分析其IL-12的表达;IFN-γ诱导试验测定其生物学活性;利用小鼠乳腺癌细胞EMT6制备小鼠肿瘤模型,尾静脉注射重组梭菌后观察其抗肿瘤效果及其毒性表现。结果 ELISA和Western blot显示重组生孢梭菌可分泌IL-12,体外与小鼠脾脏细胞共同培养可以引起IFN-γ的释放。重组生孢梭菌静脉注射到荷瘤小鼠体内后,小鼠血清IFN-γ显著增高,肿瘤萎缩。实验过程中未观察到与IL-12相关的腹泻、体重减轻和死亡等毒性作用。结论利用重组生孢梭菌生产的IL-12具有抗小鼠乳腺肿瘤作用,且没有明显毒性。     

纳米材料对细胞IGF-Ⅰ mRNA表达水平的影响

①目的探讨纳米材料对胰岛素样生长因子Ⅰ(IGF-Ⅰ) mRNA表达的影响.②方法通过原位杂交、斑点杂交及定量分析技术分别检测银系纳米材料组、稀土纳米材料组与对照组WI-38及Hela细胞IGF-Ⅰ mRNA表达.③结果银系纳米材料组、稀土纳米材料组与对照组的细胞均有IGF-Ⅰ mRNA杂交阳性信号表达.膜上斑点杂交经吸光度扫描表明,WI-38细胞及Hela细胞银系纳米材料组吸光度值与对照组相比差异均无显著性(F=12.4～31.2,tD=1.2～1.8,P>0.05);而稀土纳米材料组吸光度值较对照组均显著性降低(tD=3.2～4.6,P<0.01).④结论银系纳米材料对IGF-Ⅰ mRNA的表达无影响;而稀土纳米材料对IGF-Ⅰ mRNA的表达有较强的抑制作用,在一定程度上影响了其在医学上的应用.     

蜂毒素与基因变构IL-2嵌合蛋白的体外生物活性研究

目的:IL-2具有多种与增强免疫功能相关的生物学活性,蜂毒素对多种肿瘤细胞有杀伤作用.文中研究蜂毒素与基因变构IL-2(melittin-88ArgIL-2)嵌合蛋白在体外的生物学活性. 方法:用甲基噻唑基四唑(MTT)法研究纯化制备的melittin-88ArgIL-2嵌合蛋白在体外对T细胞增殖和NK细胞杀伤活性的影响及对人卵巢癌细胞SKOV3生长抑制的作用. 结果:melittin-88ArgIL-2嵌合蛋白在体外可促进T细胞的增值,增强NK细胞的杀伤活性,抑制人卵巢癌细胞SKOV3的生长增殖. 结论:melittin-88ArgIL-2嵌合蛋白在体外具有一定的增强免疫功能和抗肿瘤活性.值得进一步对其体内的生物学活性进行研究,为大规模制备的中试放大研究和临床前期研究提供了资料.     

hIL-12及HER2/neu ECD修饰的生孢梭菌工程菌的构建及鉴定

目的构建人IL-12(hIL-12)基因和乳腺癌靶基因HER2/neu胞外区(ECD)分别修饰的生孢梭菌工程菌,探讨其在乳腺癌基因治疗中的作用。方法将hIL-12和HER2/neu ECD的基因分别连接到厌氧梭菌的内源性β-1,4-葡聚糖酶启动子和信号肽序列(eglAp)之后,得到融合基因eglAp-hIL-12和eglAp-HER2/neu。将融合基因插入大肠杆菌-厌氧菌穿梭质粒pIMP1,得到重组质粒pIMP1-ehIL-12和pIMP1-eHER2/neu。将重组质粒首先转化大肠杆菌DH5α,通过酶切和测序鉴定无误后,再用电穿孔法转化生孢梭菌;利用红霉素抗性筛选阳性克隆,采用菌液PCR和质粒提取鉴定阳性克隆,采用ELISA法对生孢梭菌培养上清中目的产物进行分析。结果酶切和测序结果表明重组质粒内的融合基因eglAp-hIL-12和eglAp-HER2/neu序列和读框正确,菌液PCR、质粒提取和ELISA结果显示hIL-12和HER2/neu ECD基因成功修饰生孢梭菌并表达。经过20多代抗生素压力筛选,重组生孢梭菌仍能稳定携带和表达外源基因。结论成功获得hIL-12和HER2/neu ECD基因分别修饰的生孢梭菌工程菌株,为进一步的抗肿瘤研究奠定基础。     

EBV相关胃癌的临床病理学分析

目的：探讨Epstein-Barr病毒（EBV）感染与胃癌发生的关系，以及EBV相关胃癌和EBV阴性胃癌在临床病理资料方面的异同。方法：应用PCR-Southern技术检测185例胃癌及相应癌旁组织EBVDNA，并用原位杂交技术检测PCR阳性标本EBV编码的小RNA（EBERs），证实EBV感染的存在。结果：185例胃癌组织标本EBV阳性率为7．03％（13／185），而相应癌旁组织均为阴性，两种组织中EBV阳性率差异有统计学意义，X^2=11．0709，P=0．0009。结论：EBV相关胃癌和EBV阴性胃癌在性别、年龄、肿瘤大小、组织学类型、分化程度、淋巴结转移以及临床病理分期等方面差异均无统计学意义，但两组间肿瘤发生的部位差异有统计学意义。     

肿瘤坏死因子对肿瘤细胞杀伤作用的观察

探讨肿瘤坏死因子对肿瘤细胞的杀伤作用,并观察重组人干扰素对ＴＮＦα细胞毒性的协同作用。方法采用非同位素细胞毒试验,对３个子宫颈来源的细胞系进行传代培养,与ＩＦＮα接触后检测其杀伤细胞情况。