Bax/Bak siRNA对抑制小鼠早期胚胎凋亡的效应

目的:探讨Bax-小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)和Bak-siRNA对小鼠胚胎发育及凋亡的效应。方法:通过对体外培养小鼠早期胚胎激光打孔,完成Bax-siRNA(Bax-siRNA组)、Bak-siRNA(Bak-siRNA组)和Bax-Bak-siRNA(Bax-Bak-siRNA联合组)的转染,并以阴性siRNA和纯水为阴性对照组和空白对照组,对确定转染效果的胚胎观察形态变化、生长发育状况及囊胚形成率,应用Hoechst 33342和碘化丙啶的方法分析各转染组小鼠早期胚胎细胞凋亡和增殖程度以及凋亡颗粒率。结果:鼠胚激光打孔后可成功转染Bax-siRNA、Bak-siRNA和Bax-Bak-siRNA。Bak-siRNA组和Bax-Bak-siRNA联合组鼠胚的囊胚形成率显著高于阴性对照组(P<0.01),而且凋亡颗粒率显著低于阴性对照组(P<0.01)。Bax-siRNA组的囊胚形成率和凋亡颗粒率与阴性对照组比较均无统计学差异(P>0.05)。结论:Bak-siRNA和Bax-Bak-siRNA可以改善小鼠胚胎的囊胚形成率,减少胚胎细胞的凋亡。     

检测血液p53基因SNP位点的多态性与病理性瘢痕基因型的相关性

目的探讨p53基因第72位密码子单核苷酸多态性，并分析该多态性位点与病理性瘢痕的相关性。方法常规抽取105例瘢痕患者和190例健康志愿者的血液，提取DNA，设计1对针对p53基因第4外显子第72密码子单核苷酸多态性荧光探针，进行实时定量PCR分析并观察图像。结果实时定量PCR技术检测能准确区分各种基因型，抽取295例血液样品中，基因型CCC有121例，基因型CGC有88例，基因型CCC／CGC有86例，通过PCR荧光分子信标检测p53基因第72密码子单核苷酸多态性的方法。CCC基因型患病理性瘢痕的概率最高，病理性瘢痕患者的年龄及发病部位与基因型有无相关性尚待进一步研究。结论CCC基因型及单核苷酸多态性可能与病理性瘢痕形成相关。     

颗粒酶B直接裂解部分断裂的基因组DNA--颗粒酶B诱导细胞凋亡新途径

目的：颗粒酶B(Granzyme B，GraB)对核内物质具亲和力，体外除去核膜的细胞核中可观察到大量GraB聚积，观察GraB是否直接作用于基因组DNA。方法：通过抽提人外周血淋巴细胞总RNA，进行RT-PCR克隆GraB cDNA，构建GraB原核表达载体，用限制性酶切和DNA测序进行鉴定；异丙基-1-硫代-β-呋喃半乳糖苷(IPTC)诱导表达，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析表达产物。表达产物经亲和层析纯化后，观察其对基因组DNA的功能。结果：表达产物以可溶性分子形式存在于菌体中，具有良好的抗原性和特异性，特异性底物检测有活性，且具有直接作用于部分断裂的基因组DNA，使其发生进一步裂解的活性。结论：Grab直接作用于部分断裂的基因组DNA，这可能是GraB诱导细胞凋亡新的作用途径。     

人全长PLCr 1基因真核表达载体的构建及鉴定

目的构建人全长PLCr1基因真核表达载体，以便进一步研究PLCr1的作用及其机制。方法自行设计一对带有日砌Ⅲ和Not Ⅰ酶切位点的引物，采用RT-PCR技术从MG63细胞中扩增人全长PLCr1 cDNA(3878bp)，纯化后，经HindⅢ-NotⅠ酶切，插入真核表达载体pLNCX2中，构建重组质粒pLNCX2／PLCr1。通过PCR，限制性酶切分析及DNA直接测序对所构建的重组质粒进行鉴定。同时经瞬时转染后，利用RT-PCR及Western blotting转染后LoVo细胞中PLCr1的表达。结果RT-PCR产物经琼脂糖电泳分析所得片段大小与预期相符(3878bp)。重组质粒经日HindⅢ-NotⅠ酶切后，得到3878bp(PLCr1基因)及6100bp(载体pLNCX2)两个片段，同时重组质粒经HindⅢ-BglⅡ酶切后．得到约1300bp及约8500bp两个片段，与预期一致。DNA测序也证实了重组质粒的正确。经RT-PCR和Westem blot分析证实转染pLNCX2／PLCr1的LoVo细胞中PLCr1的表达均高于转染空质粒pLNCX2的LoVo细胞及未转染的LoVo细胞。结论成功构建了人全长PLCr1基因真核表达载体pLNCX2／PLCr1，为进一步研究PLCr1的作用奠定了基础。     

瘢痕疙瘩高危个体评估与p53基因第72密码子的多态性

目的:应用p53基因检测试剂盒观察不同的p53基因第72密码子多态性基因型及等位基因的表现频率,判断瘢痕疙瘩高危个体。方法:实验于2003-07/2004-10在南方医科大学细胞生物学实验室完成。采用聚合酶链反应-反向点杂交方法建立试剂盒,检测广东地区45例瘢痕疙瘩患者与60例正常对照者外周静脉血标本的p53基因第72位密码子多态性的基因型(脯氨酸/脯氨酸、脯氨酸/精氨酸、精氨酸/精氨酸)与等位基因(脯氨酸、精氨酸),观察不同分布对预测的意义,参与者均知情同意。结果:①脯氨酸/脯氨酸基因型频率:瘢痕疙瘩组明显高于对照组(20/44,15/25,P<0.036)。②脯氨酸等位基因频率:瘢痕疙瘩组明显高于对照组(56/62,57/48,P<0.034)。③脯氨酸/脯氨酸基因型者患瘢痕疙瘩的风险性:与脯氨酸/精氨酸+精氨酸/精氨酸基因型相比明显增高(比值比=2.400,95%可信区间:1.048～5.498)。结论:p53基因检测试剂盒检测出脯氨酸/脯氨酸基因型者患瘢痕疙瘩的风险性高,可以预测瘢痕疙瘩高危个体。     

转染人骨形态发生蛋白在兔骨髓间充质干细胞的表达

目的：采用基因转移技术将人骨形态发生蛋白7（hBMP-7)基因转染兔骨髓间充质干细胞（BMSc ),检测外源基因的表达。方法：常规分子生物学技术构建hBMP-7逆转录病毒载体,制备含目的基因的重组逆转录病毒液,感染兔骨髓间充质干细胞,使用原位杂交以及免疫组织化学的方法检测hBMP-7在BMSc中的表达。结果：原位杂交和组化检测经hBMP-7基因转染的BMSc中出现阳性结果,未转染的BMSc中未见阳性结果出现。结论：采用逆转录病毒介导的方法可以将hBMP-7转染至BMSc中,并有外源性基因的表达。     

血管内皮生长因子受体结合肽介导颗粒酶靶向性抗肿瘤血管生成

目的：观察血管内皮生长因子受体（VEGFR）结合肽－颗粒酶B（GraB）融合蛋白抗血管生成的作用。方法：抽提人外周血淋巴细胞总RNA，进行RT－PCR克隆GraBcDNA；抽提LoVo细胞总RNA，进行RT－PCR克隆VEGFR结合肽cDNA，用限制性酶切和DNA测序进行鉴定，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS－PAGE）分析表达产物，表达产物经亲和层析纯化后，以人血管内皮细胞（ECV304）和鸡胚尿囊膜血管测定其生物学活性。结果：表达产物以可溶性分子形式存在于菌体中，具有良好的抗原性和特异性，且具有抑内管内皮细胞增殖及破坏鸡胚尿囊膜血管形成的活性，结论：VEGFR结合肽－GraB融合蛋白具有抑制血管生成的功能，在肿瘤生物靶向治疗中有一定潜在价值。     

阻断磷脂酶C—γ1信号通路对大肠癌细胞凋亡的影响

目的 探讨磷脂酶C-γ1(PLC-γ1)信号通路被阻断对大肠癌细胞凋亡状态的影响。方法 利用U73122(1、5、10μmol／L)处理细胞以阻断PLC-γ1信号通路，光镜、电镜观察细胞形态改变，MTT法评估细胞杀伤效应，流式细胞仪分析凋亡细胞比例。结果 PLC-γ1信号通路阻断后，大肠癌细胞出现了典型的凋亡形态学改变，存活细胞明显减少，流式细胞仪检测出现典型的凋亡亚二倍体峰，凋亡细胞所占比例达到半数以上。结论 阻断PLC-γ1信号通路能够启动大肠癌细胞凋亡。     

p53基因第72位密码子多态与瘢痕疙瘩易感性研究

目的 探讨p53基因第72位密码子多态与瘢痕疙瘩遗传易感性的关系。方法 采用聚合酶链反应-反向斑点杂交、DNA直接测序方法，检测了15例瘢痕疙瘩患者与15名正常人对照的p53基因第72位密码子的基因型。结果 瘢痕疙瘩组的Pro等位基因及Pro／Pro基因型频率明显高于对照组(P值分别为0．035、0．030)，Pro／Arg、Arg／Arg基因型频率在病例组和对照组的分布差异无显著性。结论 p53基因第72位密码子Pro等位基因及Pro／Pro基因型可能是瘢痕疙瘩的易感因素。