myc和ras癌基因共整合转基因小鼠的建立

MMTV－H3－c－myc和MMTV－v－Ha－ras癌基因DNA混合显微注射到小鼠受精卵中，并移植到假孕母鼠输卵管内，获得出生后断奶健康小鼠95R（♀55，♂40）。经过斑点杂交显示myc正反应小鼠17只（♀12，♂5），ras正反应小鼠12只（♀7，♂5）。在全部25只癌基因正反应小鼠中，有4只为myc＋ras双重正反应，均为雌性。继续进行Soutnern印迹分析，确认myc正反应小鼠为“建成者”转基因小鼠。许多转基因小鼠发生各种肿瘤。     

人全长PLCγ1基因真核表达载体的构建及鉴定

目的构建人全长PLCγ1基因真核表达载体,以便进一步研究PLCγ1的作用及其机制。方法自行设计一对带有HindⅢ和NotⅠ酶切位点的引物,采用RT-PCR技术从MG63细胞中扩增人全长PLCγ1cDNA(3878bp),纯化后,经HindⅢ-NotⅠ酶切,插入真核表达载体pLNCX2中,构建重组质粒pLNCX2/PLCγ1。通过PCR,限制性酶切分析及DNA直接测序对所构建的重组质粒进行鉴定。同时经瞬时转染后,利用RT-PCR及Westernblotting转染后LoVo细胞中PLCγ1的表达。结果RT-PCR产物经琼脂糖电泳分析所得片段大小与预期相符(3878bp)。重组质粒经HindⅢ-NotⅠ酶切后,得到3878bp(PLCγ1基因)及6100bp(载体pLNCX2)两个片段,同时重组质粒经HindⅢ-BglⅡ酶切后,得到约1300bp及约8500bp两个片段,与预期一致。DNA测序也证实了重组质粒的正确。经RT-PCR和Westernblot分析证实转染pLNCX2/PLCγ1的LoVo细胞中PLCγ1的表达均高于转染空质粒pLNCX2的LoVo细胞及未转染的LoVo细胞。结论成功构建了人全长PLCγ1基因真核表达载体pLNCX2/PLCγ1,为进一步研究PLCγ1的作用奠定了基础。     

瘢痕疙瘩发病风险与p53基因第72位密码子多态性的关系

目的 研究p53基因第72位密码子多态性与瘢痕疙瘩发病风险的关系。方法 采用聚合酶链反应-反向点杂交、DNA直接测序方法检测了45例瘢痕疙瘩患者与60名正常对照的p53基因第72位密码子多态性位点的基因型。结果 瘢痕疙瘩患者的Pro等位基因频率明显高于正常对照组(x^2=4．485，P=0．034)。瘢痕疙瘩患者的Pro／Arg、Arg／Arg基因型频率与正常对照组相比差异无统计学意义(x^2值分别为0．949和1．346；P值分别为0．330和0．246)，而瘢痕疙瘩患者的Pro／Pro基因型频率明显高于对照组(x^2=4．375，P=0．036)。提示Pro／Pro基因型者患瘢痕疙瘩的风险性明显高于Pro／Arg、Arg／Arg基因型者(OR=2．400，95％CI：1．048～5．498)。结论 p53基因第72位密码子多态性位点的基因型检测可能对判断瘢痕疙瘩高危个体具有指导意义。     

T103A变异MxA蛋白抑制水泡性口膜炎病毒复制的体外研究

目的研究T103A变异MxA蛋白抑制水疱性口膜炎病毒（VSV）复制活性。方法将野生型、T103A变异MxA蛋白表达载体和对照质粒分别瞬时转染Wish细胞,24h后VSV感染细胞,48h后用MTr法检测各组细胞增殖;另取Wish细胞转染上述3种质粒,转染24h加入VSV感染细胞,24h后收集细胞采用RT-PCR检测VSVmRNA水平;Western blot检测各组MxA蛋白表达。结果野生型、T103A变异MxA蛋白均在Wish细胞有较好表达;MTT检测结果提示T103A变异组细胞增殖数显著低于野生型组（P〈0．01）;RT—PCR结果显示T103A变异组VSVmRNA水平显著高于野生型组（P〈0．01）,但与对照组比较差异无统计学意义（P〉0．05）。结论T103A变异MxA蛋白失去了抑制VSV复制活性。     

K83A变异MxA蛋白抑制VSV复制的体外研究

目的研究K83A变异对MxA蛋白抑制VSV复制活性的影响。方法将野生型和K83A变异MxA蛋白载体pcDNA3.1-MxA（WT和K83A）分别瞬时转染Wish细胞,24h后VSV感染细胞,感染48h后MTT检测各组细胞增殖;另取Wish细胞转染MxA载体和对照DNA,24h后加入VSV,感染24h后收集细胞RT-PCR检测VSVmRNA水平;Western blot检测各组MxA蛋白表达水平。结果野生型和K83A变异MxA蛋白均在Wish细胞有较好表达;MTT检测结果提示K83A组细胞增殖数明显低于WT组（P〈0.01）,RT-PCR结果显示K83A组VSVmRNA水平明显高于WT组（P〈0.01）,但与对照组比较差异无统计学意义（P〉0.05）。结论K83A变异MxA蛋白使MxA蛋白失去了抑制VSV复制的活性。     

L612K变异MxA蛋白体外抑制水泡性口膜炎病毒复制的研究

目的研究L612K变异MxA蛋白抑制水泡性口膜炎病毒（VsV）复制活性。方法将野生型MxA蛋白重组表达载体pcDNA3.1MxA（wT）和L612K变异MxA蛋白载体pcDNA3.1-MxA（L612K）分别瞬时转染Wish细胞，24h后VsV感染细胞，感染后48hMTT检测各组细胞增殖数；另取wish细胞转染MxA载体和对照DNA，24h后加入VsV，感染24h后收集细胞，RT-PCR检测VSV mRNA水平，Western blot检测MxA蛋白的表达水平。结果野生型和L612K变异MxA蛋白均在wish细胞有较好表达；MTT检测L612K变异组细胞增殖数明显低于野生型（t=1.13，P〈0.01），RT-PCR检测L612K变异组VsVmRNA水平明显高于野生型组（t=0.13，P〈0.01）。结论L612K变异可能使MxA蛋白降低了对VsV的抑制活性。     

双歧杆菌的完整肽聚糖对小鼠腹腔巨噬细胞线粒体膜电位的影响

为探讨双歧杆菌的完整肽聚糖(WPG)对小鼠腹腔巨噬细胞线粒体膜电位的影响,首先分离培养昆明小鼠腹腔巨噬细胞,然后以WPG刺激巨噬细胞,用四甲基罗丹明乙酯(TMRE)标记线粒体膜电位,最后用激光共聚焦显微镜检测巨噬细胞内荧光强度的变化。和对照组相比,WPG刺激巨噬细胞后,巨噬细胞内反映线粒体膜电位的荧光强度明显增强。双歧杆菌的WPG在激活巨噬细胞的过程中可提高其线粒体膜电位。     

瘢痕疙瘩p53基因检测试剂盒的研制

p53蛋白的聚集现象。并与p53基因突变或缺失有关。p53基因第4外显子的第72密码子具有CCC／GGC的单核苷酸多态性，其编码的氨基酸分别为脯氨酸(Pro)和精氨酸(Arg)。在前阶段研究中发现p53基因第72密码子多态性与瘢痕疙瘩的发生有关基础上，本实验旨在设计并装配成一套p53基因检测试剂盒，用于预测瘢痕疙瘩高危个体。     

表达干扰素-α2b重组长双歧杆菌工程菌的制备

目的构建表达人干扰素-α2b(hIFN-α2b)蛋白的双歧杆菌工程菌,并验证靶蛋白的表达水平。方法人工合成hIFN-α2b基因,插入双酶切的pBAD质粒,构建重组质粒pBAD-IFN。制备双歧杆菌感受态,用pBAD-IFN电转化后PCR鉴定、筛选阳性克隆,筛选的阳性双歧杆菌克隆在L-阿拉伯糖诱导下表达靶蛋白,并进行Western blot检测。结果测序和双酶切鉴定表明成功构建重组质粒pBAD-IFN,Western blot检测证明氨苄青霉素筛选出的该质粒转化双歧杆菌阳性克隆经L-阿拉伯糖诱导表达分子质量单位为18ku的hIFN-α2b蛋白。结论 hIFN-α2b表达载体pBAD-IFN转化双歧杆菌后可表达hIFN-α2b蛋白。     

临床医学七年制细胞培养教学改革探讨

细胞培养技术是医学研究生从事课题研究必备的一项基本技能。近年来，将创新能力培养作为教学改革的核心，积极探索适合七年制医学生的教学内容与方法，使学生不仅学习了细胞培养技术的相关理论与操作技术，而且锻炼了科研意识与科学思维，极有利于高素质医学专门人才的培养。