肝细胞生长因子受体在宫颈癌组织中的表达及其与增殖细胞核抗原的关系

目的：研究肝细胞生长因子受体（c-met）在宫颈癌中的表达，探讨其与增殖细胞核抗原（PCNA）的关系。方法：运用免疫组化（SP）方法检测14例慢性宫颈炎和50例宫颈癌组织中c-met及PCNA的表达率。结果：在慢性宫颈炎组织，c-met表达阳性率为14.3%（2/14），而在宫颈癌组织，其表达阳性率为62.0%（31/50），两者比较差异有显著性（P<0.05）。组织分化程度低组c-met表达率高于分化程度高组（P<0.05），淋巴结转移组的c-me t表达率明显高于无淋巴结转移组（P<0.05），鳞癌组与腺癌组c-met表达率比较差异无显著性（P>0.05），临床Ⅰ期和Ⅱ期组c-met表达量比较差异无显著性（P>0.05）。在慢性宫颈炎组织中，PCNA指数为24.79%±5.1%，在宫颈癌组织中，PCNA指数为39.9%±15.46%，两者比较差异有显著性（P<0.05）。组织分化程度越低、临床分期越晚PCNA的表达量越高(P<0.05)，鳞癌组与腺癌组的PCNA表达量比较差异无显著性（P>0.05）。c-met阳性表达组的PCNA指数明显高于c-met阴性表达组（P<0.01）。结论：c-met的表达与PCNA密切关联，可作为评估宫颈癌预后的一个指标。     

人铜锌超氧化物歧化酶原核表达载体的构建、表达及蛋白纯化

目的构建人铜锌超氧化物歧化酶（hCu，Zn-SOD）原核表达载体并诱导其表达，纯化及鉴定目的蛋白，为其临床应用奠定基础。方法根据已报道的hCu，Zn-SOD基因序列，采用RT-PCR技术从外周血单个核细胞（PBMC）中获得SOD cDNA序列。将所得的PCR产物插入克隆载体pGEM-Teasy中，重组质粒经酶切，PCR及测序鉴定正确后，将目的片段插入原核表达载体PET20b（＋）中并转化大肠杆菌DE3，通过IPTG诱导表达出目的蛋白，经镍固定金属亲和层析纯化。采用邻苯三酚自身氧化法测定SOD生物学活性。结果序列分析表明SOD基因成熟肽编码区含有465bp与GenBank（X02317）中已报道序列一致的SOD核苷酸。经IPTG诱导表达，SDS-PAGE电泳和免疫印迹分析显示表达的目的蛋白分子质量约为19kD并与商品化的人SOD单抗呈特异性反应。经Ni^2＋-NTA琼脂糖纯化获得SDS-PAGE电泳下单一条带。可溶蛋白酶活力达1300U／ml。结论在大肠杆菌中获得了人SOD的高效表达，为研究其生物学功能和广泛应用奠定了基础。     

CEA串连表位-HSP70融合基因疫苗诱导小鼠的表位特异性免疫应答

目的：观察癌胚抗原(CEA)串联表位-HSP70融合基因疫苗诱导的免疫应答，为开发新型肿瘤特异性基因疫苗奠定基础。方法：在已经构建含有变异热休克蛋白(HSP)序列的基础上，插入重组CEA串联表位的编码片段获得CEA串联表位-HSP融合基因疫苗。3次肌肉注射免疫Balb/c小鼠，设立注射生理盐水的阴性对照组、注射氢氧化铝佐剂混悬CEA串联表位的阳性对照组及注射pCITriCEA_625-667-mtHSP70的实验组。FCM分析脾脏T细胞亚群；体外培养脾细胞，ELISA检测培养上清中干扰素γ(IFNγ)的相对含量；同时测定小鼠血清CEA特异性抗体的滴度。结果：阴性对照组脾细胞中CD3⁺和CD4⁺T细胞分别为55.1%±6.1%和30.2%±4.1%；实验组脾细胞中CD3⁺和CD4⁺T细胞分别为78.7%±9.2%和48.9%±4.7%，两组比较差异有显著性(P<0.01)。其体外特异性抗原肽诱导的IFNγ分泌处于本底水平，可视为生理性参数，体外非特异性和特异性的IFNγ分泌分别增加3和6倍(P<0.01)。血清中CEA表位特异性抗体滴度阴性对照组为0，阳性对照组＜1∶500,而融合基因疫苗免疫组达到1∶4 000。结论：CEA串联表位-HSP融合基因疫苗在体内诱导以激发辅助性T细胞为特征的免疫应答。     

人脐带间充质干细胞培养上清对米非司酮处理的人子宫内膜基质细胞存活、凋亡和子宫内膜容受性的影响

目的：探讨人脐带间充质干细胞培养上清（hUCMSCs-Sup）对米非司酮（Ms）处理的人子宫内膜基质细胞（hEndoSCs）增殖、凋亡和子宫内膜容受性的影响,并阐明其可能的作用机制。方法：体外培养hEndoSCs,分为对照组和40、60、80及100μmol·L-1 Ms组,MTT法检测各组细胞存活率。hEndoSCs分为对照组、40μmol·L-1 Ms组和60μmol·L-1 Ms组,流式细胞术检测各组细胞凋亡率,Western blotting法检测各组细胞中凋亡相关蛋白B细胞淋巴瘤2 (Bcl-2)和Bcl-2相关X蛋白（Bax）蛋白表达水平并计算Bcl-2/Bax比值。hUCMSCs-Sup作用后,hEndoSCs分为对照组、Ms组、Ms+hUCMSCs-Sup组和Ms+hUCMSCs-Sup+3-甲基腺嘌呤（3-MA）组,MTT法检测各组细胞存活率,流式细胞术检测各组细胞凋亡率,Western blotting法检测各组细胞中微管相关蛋白1轻链3B-Ⅱ（LC3B-Ⅱ）和微管相关蛋白1轻链3B-Ⅰ（LC3B-Ⅰ）蛋白表达水平并计算LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ比值,实时荧光定量P...     

CEA迷你基因串联体肿瘤疫苗的构建

目的：构建人癌胚抗原（CEA）的迷你基因串联体肿瘤疫苗。方法：通过PCR从人基因组中得到一段来源于CEA的DNA序列,其中包含两个编码辅助性T细胞（HTL）表位的迷你基因,插入pGEM-T easy载体后测序,再将目的基因以同尾酶连接的方式顺次定向亚克隆到真核表达载体 pcDNA3.0中,得到三串联体,以 PCR和酶切方法鉴定构建的重组真核表达质粒 pc DNA3.0-triCEA_625-667。结果:PCR和酶切结果表明,获得的目的基因与所选的基因片段 CEA_625-667中包含的碱基数量吻合,且带有正确的酶切位点。测序结果与GenBank登记完 全相同。构建的重组真核表达质粒中含有正确编码的经同尾酶连接的目的基因片段三倍体。结论：成功地构建了含有CEA_625-667基因三串联体的DNA疫苗。     

人Ⅱ型胶原反应性T细胞克隆的建立及其抗原反应性

目的 建立人Ⅱ型胶原(CⅡ)反应性T细胞克隆，探讨其抗原反应性。方法从健康人外周血中建立一个与CⅡ反应的T细胞克隆(TC9)[^3H]，dThd掺入法检测克隆TC9对不同胶原的T细胞增殖反应及对人CⅡ的HLA—DR限制性，流式细胞术分析TC9的细胞表型。结果 建立了一个与CⅡ反应的HLA—DR7限制性TC9，TC9识别天然的与变性的人CⅡ，与人Ⅰ型胶原和牛Ⅱ型胶原存在交叉反应性；TC9存在CD4和CD29的阳性表达。结论 对CⅡ反应的TC9是一种有意义的自身抗原，这对进一步去构建与治疗相关的抑制肽或封闭抗体有重要作用。     

人Ⅱ型胶原反应性T细胞克隆、T细胞受体β链的作用

目的 探讨人Ⅱ型胶原(CⅡ)反应性T细胞克隆(TC9)、T细胞受体β链的作用。方法 通过切割和纯化人CⅡ片段以定位T细胞表位，分子克隆并测序TC9的TcRβ链基因。结果 与CⅡ反应的HLA—DR7限制性TC9其T细胞受体β链由Vβ6．7、Jβ2．3、Cβ2以及序列尚不清楚的D片段构成。结论 对CⅡ反应的TC9的TcRβ链是一种有意义的自身抗原，对进一步研究与CⅡ相关的类风湿性关节炎发病机制及特异性治疗有重要作用。     

IFN-γ对体外培养系统中IL-18诱导的肿瘤快速杀伤效应的影响

目的 :建立体外培养系统 ( CCs) ,应用 rh IL- 1 8在 CCs中诱导肿瘤快速杀伤效应 ,探讨IFN- γ在快速杀伤效应中的作用。方法 :采用 Stem Sep TM免疫磁性细胞分离法分离人外周血 NK细胞、T细胞及树突状细胞 ( DCs) ;流式细胞仪分析细胞表型 ;细胞毒实验检测杀伤活性 ;ELISA方法检测 IFN-γ的产生量。结果 :在 CCs中 ,rh IL- 1 8能单独诱导一种快速肿瘤杀伤作用 ,其杀伤作用随rh IL- 1 8浓度的增加而增高 ;rh IL- 1 8能够诱导 CCs产生 IFN-γ,并促进 m RNA的表达 ,但其作用不如 rh IL- 1 2 + rh IL- 1 8明显 ;抗 IFN- γ单抗对 rh IL- 1 8诱导的快速肿瘤杀伤效应无明显影响。结论 :IL- 1 8能够在 CCs中有效地诱导快速肿瘤杀伤效应 ,且这种杀伤效应不依赖 IFN- γ无关途径     

重组可溶性TRAIL的表达及其诱导A549和H460wt细胞凋亡

目的：获得人重组可溶性肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(rsTRAIL)蛋白,并探讨其应用于非小细胞肺癌(NSCLC）治疗的前景。方法：RT-PCR从外周血单核细胞(PBMCs)中获取目的基因片段,构建重组质粒PQE₃0-TRAIL并转化入大肠杆菌(E.coli)M₁5,IPTG诱导目的蛋白表达并经镍固定金属亲和层析纯化,MTT法检测细胞增殖情况,荧光显微镜观察H460^wt细胞的形态学改变,流式细胞仪检测其凋亡率。结果：获得与GenBank中报道一致的TRAIL基因片段。SDS-PAGE电泳和免疫印 迹分析显示,获得具有TRAIL免疫原性、相对分子质量约为21 000目的蛋白。Ni²⁺-NTA agarose纯化得到单一条带蛋白。rsTRAIL处理H460^wt细胞24 h后,细胞凋亡率为43.2％,顺铂可以增强rsTRAIL对A549细胞的杀伤作用。结论：获得了与天然TRAIL蛋白具有相同生物学活性的目的蛋白,该目的蛋白具有诱导NSCLC细胞凋亡的作用,联合顺铂能够增强rsTRAIL对NSCLC的杀伤作用。     

人白细胞介素24基因的克隆及在大肠杆菌中的高效表达

目的：构建人白细胞介素24（hIL-24）基因原核表达载体,在大肠杆菌中诱导表达hIL-24蛋白,并测定其生物学活性。方法：用PCR方法从含有hIL-24的质粒中扩增hIL-24 cDNA序列,测序鉴定正确后,应用基因重组技术构建PQE/hIL-24,并转入大肠杆菌(E.coli)M15。IPTG诱导表达目的蛋白,镍凝胶亲和层析纯化目的蛋白,SDS-PAGE电泳和免疫印迹分析鉴定结果,应用外周血单核细胞（PBMCs）,通过ELESA法分别在48和72 h检测rhIL-24刺激的PBMCs中 IL-6、IFN-γ及TNF-α产生情况。结果：获得与GenBank中报道一致的hIL-24基因片段。SDS-PAGE电泳和免疫印迹分析显示,获得具有hIL-24免疫原性、相对分子质量约为18 400目的蛋白。Ni²⁺-NTA agarose纯化得到单一条带蛋白, 获得rhIL-24蛋白刺激的PBMCs,PBMCs分泌IL-6、IFN-γ、TNF-α的水平显著高于未刺激前分泌水平(P<0.05),rhIL-24具有与天然hIL-24蛋白相同的生物学活性。结论 成功地构建了hIL-24的原核表达载体,在E.coli中高效表达了rhIL-24蛋白,获得了与天然hIL-24蛋白具有相同生物学活性的rhIL-24。