反向点杂交快速诊断非缺失型α-地中海贫血

目的 建立一种简便快速筛查非缺失型α—地中海贫血点突变的反向点杂交(reverse dot blot,RDB)技术。方法 将生物素直接标记在引物上,选择性扩增人α2珠蛋白基因,将PCR产物与固化在膜条上的寡核苷酸探针杂交,洗膜、显色后分析结果。结果 采用生物素标记的引物：Bio—C1和Bio—C3可选择性扩增α2珠蛋白基因,PCR产物长度为1085bp,该标记片段与固相探针构成的反向点杂交检测体系,可以分辨出中国人群中已知的6种非缺失型α—地中海贫血点突变。结论 该反向点杂交检测体系无需巢式PCR扩增,一步选择性扩增的α2珠蛋白基因产物即可用于杂交;无需进行检测标记物(如生物素)反应,而将生物素直接标记在引物上;无需不同的洗膜条件,故较已报道的同类方法更为简单易行。RDB技术可用于快速诊断中国人非缺失型α—地中海贫血点突变。     

大引物PCR定点诱变技术的研究进展

PCR技术自问世以来发展迅速 ,现已成为细胞生物学及分子生物学研究中常用的方法。而基于 PCR的定点诱变技术又成为研究基因的生物学特性 ,探索蛋白质结构和功能相关关系的强有力工具。其中的大引物 PCR定点诱变技术因其简便高效而倍受研究者欢迎。本文从该技术的每一层面入手 ,对此方法的研究进展进行概述     

抗人ξ珠蛋白链不同表位单克隆抗体的制备和鉴定

目的制备和鉴定抗ξ珠蛋白链单克隆抗体。方法用纯化的重组ξ珠蛋白链免疫Balb／c小鼠，取其脾细胞与NS-1细胞融合制备杂交瘤，经重组的ξ珠蛋白链筛选和3次克隆化，从制备的腹水中纯化单克隆抗体。结果和结论获得3株杂交瘤细胞IA12、3H9及4D11，其分泌单抗的亚型分别为IgG2a、IgG1和IgG1；双抗体夹心ELISA结果证明3株单抗均可结合重组的及东南亚（--^SEA）缺失型地中海贫血基因携带者血中的ξ珠蛋白链，且其中IA12和3H9识别的位点为不同表位。这三株抗体将为筛选地中海贫血基因携带者的免疫检测提供有力工具。     

酶标寡核苷酸探针进行β地中海贫血的产前诊断

使用辣根过氧化物酶（ＨＲＰ）标记７对寡核苷酸探针对血液学常规筛查中检出的夫妇双方均为β地中海贫血的家系实行产前诊断，对２５例高风险胎儿的产前诊断显示，７例为纯合子或双重杂合子，１３例为单一突变的杂合子，说明用基因诊断技术筛查本病准确可靠，有利于优生优育，本文提示目前血液学筛查方法有一定的局限性。     

一个HPFH复合β地中海贫血家系的基因分析及其高危胎儿的产前基因诊断

目的调查一种缺失型遗传性持续性胎儿血红蛋白综合征（ＨＰＦＨ）的基因型和表型的关系;探索进行β地中海贫血（地贫）复合这种缺失型ＨＰＦＨ的高风险胎儿的快速产前诊断方法。方法用跨越断裂点的三引物聚合酶链反应直接分析法检测ＨＰＦＨ缺失突变;用反向点杂交技术筛查β地贫基因突变。结果发现先证者（中间型地贫患儿）为一种缺失型ＨＰＦＨ和β地贫双重杂合子,其ＨＰＦＨ基因自母方遗传,在该家系三代６名成员中共检测到４例携带了这一基因;β地贫基因［密码子１４１５（＋Ｇ）移码突变］自父方遗传。在此基础上,我们对该家庭的中间型地贫高风险胎儿进行了产前基因诊断,结果显示胎儿的基因型与先证者完全相同,为ＨＰＦＨ和β地贫双重杂合子,故建议终止妊娠。人工流产后取样分析进一步证实了产前诊断的结果。结论这是国内首次完成并报告的对由ＨＰＦＨ基因与β地贫点突变双重杂合导致的中间型地贫高风险胎儿的产前诊断。所采用的技术简便、快速,可用作解决同类事件的参考。     

用跨越断裂点的PCR技术快速诊断一种HPFH缺失突变

目的建立一种简便快速检测缺失型遗传性持续性胎儿血红蛋白综合征（ｈｅｒｅｄｉｔａｒｙｐｅｒｓｉｓ－ｔｅｎｃｅｏｆｆｅｔａｌｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ,ＨＰＦＨ）的ＰＣＲ基因诊断技术。方法基于本室通过序列测定获得的该基因断裂点周围新的ＤＮＡ顺序资料,采用跨越断裂点的三引物双重ＰＣＲ设计方案,１个共用引物与２个分别针对正常和突变基因的引物在单管反应中构成２对特异性的ＰＣＲ反应。结果２个特异性扩增片段分别为５６５ｂｐ和３７６ｂｐ,与预期的ＰＣＲ产物大小相符,其中５６５ｂｐ为正常等位基因的扩增产物;３７６ｂｐ产物示缺失型等位基因。此三引物双重ＰＣＲ可在同一反应体系中进行,其结果能区别样品的不同基因型。结论该法简便快速,可作为常规方法用于临床疑诊样品的分子筛查。     

广西地区79例β-地中海贫血复合α-地中海贫血患者血液学特征分析

目的 分析探讨β-地中海贫血(地贫)复合α-地贫的血液学表型特征,以及调查广西地区β-地贫复合α-地贫的发生率.方法 对370例广西中小学生β-地贫基因携带者进行α-地贫基因突变检测分析,并依据不同的α、β基因型组合及不同性别进行分组,运用单因素方差分析法(one-way anova)分析β-地贫复合α-地贫患者的血液学表型特征.结果 370例β-地贫基因携带者中有79例同时合并有α-地贫基因突变,占总数的21.35％,占广西地区调查人群总数的1.36％;共鉴定到31种不同的α/β基因型组合,其中,除了3例β-地贫复合αααanti3.7/αα和2例β654(C→T)/βA复合-α3.7/αα具有中间型地贫表型外,其余的74例β-地贫复合α-地贫患者均表现为轻型β-地贫特征.和单纯β-地贫杂合子相比,复合型α-和β-地贫中的β+α0组HGB、红细胞平均体积(MCV)和红细胞平均血红蛋白含量(MCH)明显增高.而复合型中,β+α0组的MCV、MCH及HGB水平要高于β+α+组.结论 与单纯β-地贫基因携带者相比,β-地贫复合α-地贫的个体表型相对较轻,虽存在一定的统计学意义,但仅通过个体间的血液学特征比较并不能准确鉴别复合型个体与单纯β-地贫杂合子个体,确诊必须依赖于分子诊断.     

Detection and amplification of Helicobacter pylori urease gene A in gastric biopsies by using nested polymerase (?)hain reaction

A nested polymerase chain reaction(N-PCR)for the spegific detection of Helicobacterpylori(H.pylori)was developed with two primer pairs(nested primers)derived from ureasegene A of H.pylori.The N-PCR was used to detect 21 different samples of H.pylori including20 clinical isolates and 1 reference strain NCTC 14126,but it was negative for other bacterialspecies,showing the N-PCR assay to be 100% specific.Tenfold serial dilution experiments re-vealed the detection of as little as 0.1 fg of H.pylori DNA by N-PCR.To evaluate the PCR as-say for clinical samples,gastric biopsies were tested with N-PCR,and the results were comparedwith those of culture,urease test and histologic examination(reference standard,RS).In 30biopsy specimens,H.pylori DNA sequences were detected by PCR in all of 20(100%)positivetissue and none of the 10 negative tissues.PCR is a specific and sensitive method that can detectthe presence of H.pylori without the need for culture and would have significant importance di-agnostically and epidemiologically.