反义RNA对培养的红系细胞βIVS—2—654C→T基因剪接缺陷的纠正

目的观察反义ＲＮＡＡ２对培养的红系细胞中βＩＶＳ－２－６５４Ｃ→Ｔ（β６５４）突变基因剪接异常的纠正作用。方法将构建的反义核酸真核表达载体通过脂质体介导转染培养的成人红系细胞（ｈＡＥ），应用逆转录－聚合酶链式反应（ＲＴ－ＰＣＲ）定量测定β珠蛋白ｍＲＮＡ及微量珠蛋白生物合成技术分析转染前后ｈＡＥ细胞内珠蛋白基因表达的变化。结果β６５４／β４１－４２基因型ｈＡＥ细胞内，正常剪接的βｍＲＮＡ占总βｍＲＮＡ的比例从转染前的０．０２４上升到第８天的０．３８０；β６５４／βＡ基因型ｈＡＥ细胞从０．３９６上升到０．８８３；与此相应，新合成的β珠蛋白链也出现升高：β６５４／β４１－４２基因型ｈＡＥ细胞β／α比值从０．０５２升至０．３５９，β６５４／βＡ基因型ｈＡＥ细胞从０．６２４升至０．８２０；正常人ｈＡＥ细胞珠蛋白基因表达不受反义ＲＮＡ的影响。结论反义ＲＮＡＡ２能有效地纠正ｈＡＥ细胞内β６５４ｍＲＮＡ前体异常剪接，进而明显地升高β珠蛋白链的合成，为β６５４地中海贫血的反义ＲＮＡ治疗提供了科学依据。     

在HeLa细胞中表达人βIVS—Ⅱ—nt—654C→突变基因

OBJECTIVE: To establish a cell model expressing human betaIVS- II -nt 654C --> T allele (beta654 mutant). METHODS: DNA fragment of entire beta-globin gene encompassing the codon region and poly(A) signal of the allele was amplified by long PCR from the genomic DNA of a homozygote with beta65.4 mutation. The amplified fragments were cloned into the Hind III and Xba I sites of the pcDNA3.1 vector. After reidentification of the clone with beta654 mutant by DNA sequencing, the recombinant plasmid was transfected into HeLa cell using liposome method. The expression of the beta654 mutant gene in the transfected cells was detected by RT-PCR. RESULTS: Both the normally processed beta globin mRNA (183bp) and aberrant processed beta globin mRNA (256bp) were identified in the transfected HeLa cells, while no RT-PCR product was detected in the controls. CONCLUSION: The transfected HeLa cells can express human beta654 allele.     

造血微环境中的蛋白聚糖

蛋白聚糖(PG)是造血微环境中重要的大分子物质,能与造血因子等特异性地结合,在造血干细胞粘附基质细胞及造血调控中有重要作用。对PG的深入研究,有助于认识在生理及病理情况下的造血调控,从而能更有效地治疗造血失控引起的血液疾病。     

羟基脲对βIVS－Ⅱ－654C→T基因表达的影响

为研究羟基脲（ＨＵ）对βＩＶＳ－Ⅱ－６５４Ｃ→Ｔ基因表达的影响，应用成人红系细胞体外液体培养模型，微量珠蛋白肽链生物合成速率测定和逆转录－多聚酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）介导的珠蛋白ｍＲＮＡ定量测定技术，研究了βＩＶＳ－Ⅱ－６５４Ｃ→Ｔ剪接缺陷型β＋地中海贫血（地贫）患者的培养红细胞在低浓度（５０μｍｏｌ／Ｌ）ＨＵ作用下珠蛋白基因表达的变化。结果表明，突变基因正常剪接的β珠蛋白ｍＲＮＡ含量升高，伴随红细胞内β珠蛋白肽链合成增加。这一结果不仅与ＨＵ治疗β地贫患者的临床结果一致，而且提示ＨＵ可能具有改善ＩＶＳ－Ⅱ－６５４Ｃ→Ｔ基因剪接加工的作用，从而对其表达产生影响     

白血病微小残留病的检测

防治白血病复发是目前国内外白血病治疗的重点。估计白血病复发的根源是体内微小残留病(MRD)对维持化疗不敏感或化疗停止后再次大量增殖,然而其确切机制尚待进一步研究。因而检测 MRD,研究残留白血病细胞生物学特性,有助于揭开白血病复发之谜,为治愈白血病指出方向。研究 MRD,首先要建立十分敏感而可靠的检测方法。本文综述了目前应用的几种检测途径及其存在的问题,以及 MRD 在临床、生物学上的意义。     

正常成人外周血红系细胞液体培养──细胞成熟分化与珠蛋白基因表达

正常成人外周血细胞经二步法培养，可得到９０％以上纯度的红系细胞。并且红系细胞随培养时间延长，不断向成熟分化，红系细胞数目增多。以逆转录多聚酶链反应法检测该培养体系内珠蛋白链ｍＲＮＡ相对含量。结果表明：随着红系细胞成熟分化，细胞内β－ｍＲＮＡ表达升高，而γ－ｍＲＮＡ表达下降。表明二步法建立的红系细胞液体培养较好地模拟了红系细胞发育的生理状态，为体外研究珠蛋白基因转换提供了良好模型。     

体外培养人骨髓基质细胞的超微结构

体外培养人骨髓基质细胞的组成及功能与人体造血微环境相似，可作为研究人体造血微环境的良好模型。选择体外培养第４周的人周髓基质细胞层，经固定、脱水、原位包埋、超薄切片染色后电镜观察。结果：可见基质层由３类基质细胞及ＥＣＭ组成。     

阿糖胞苷对人骨髓细胞长期培养的影响

人骨髓细胞长期培养加入３５μｇ／ｍｌ阿糖胞苷并孵育１小时后中止，然后继续培养，４周龄ＬＴＨＭＣ的造血被抑制；但１８周龄ＬＴＨＭＣ则表现为培养上清液中非粘附细胞数上升，１４天达高峰，基质层出现造血区，原已退缩的基质层有新的基质细胞生长。提示１８周龄ＬＴＨＭＣ仍有造血潜力，其基质层仍存在造血干细胞。     

人骨髓细胞体外长期培养基质层细胞的分类及其变化

人骨髓细胞体外长期培养基质层细胞按其核浆、形态特征分为四类：ＡＣ１最大，有数个明显核仁，胞浆呈薄纱状；ＡＣ２与巨噬细胞类似，核小深染，胞内有吞噬物；ＡＣ３最显著的特征是胞浆内广泛分布的脂质空泡；ＡＣ４最小，核大深染，胞浆少。从培养第４周至第８周，ＡＣ１及ＡＣ２分别从２１．７５％、３１．２５％上升至４０．５％、５５％；ＡＣ３及ＡＣ４分别从３１％、１５．５％降至１．５％、３％。碱性磷酸酶－抗碱性磷酸酶（ＡＰＡＡＰ）法检测细胞表面抗原，可见ＡＣ１纤维联结蛋白阳性，ＡＣ２的ＣＤ６８强阳性，ＡＣ３的纤维联结蛋白弱阳性，ＡＣ４的上两种单抗及因子ＶＩＩＩ相关活性抗原均标记阴性。本实验结果可作为一个参考值，衡量在各种实验条件下基质层细胞组成的变化。