ANGPTL4基因在3T3-L1前脂肪细胞诱导分化过程中表达水平的变化

目的观察血管生成素样蛋白-4（Angiopoietin-like protein 4,ANGPTL4）基因在3T3-L1前脂肪细胞诱导分化过程中表达水平的变化,探讨ANGPTL4基因与脂肪细胞分化的关系。方法体外培养3T3-L1前脂肪细胞,在3T3-L1前脂肪细胞分化成熟过程中（0-10 d）,采用油红O染色,观察脂肪细胞分化及脂质积聚情况;采用Real-time PCR、逆转录PCR技术检测脂肪细胞分化标志基因（LEPTIN,ADIPONECTIN）和ANGPTL4 mRNA表达;采用Western blot检测ANGPTL4蛋白表达。结果随着脂肪细胞诱导分化逐步深入,油红O染色显示,细胞中脂滴形成逐渐增多,达到占全视野95%以上;同时瘦素（LEPTIN）和脂联素（ADIPONECTIN）基因在诱导后的第2天开始表达并逐步增多,均提示脂肪细胞分化逐步成熟。ANGPTL4 mRNA和蛋白在前脂肪细胞中低表达,分化第2-6天ANGPTL4基因表达显著上调,分化第8-10天ANGPTL4基因表达保持在较高水平并趋于稳定。结论在3T3-L1前脂肪细胞分化过程中ANGPTL4基因表达上调,ANGPTL4基因可能参与了脂肪细胞分化。     

与人体肥胖相关的神经肽Y受体Y1基因的克隆及序列分析

目的 克隆与肥胖相关的人神经肽Y受体Y1(NPYlR)基因,并鉴定该克隆基因序列的正确性.方法 从人的脂肪组织中提取总RNA并进行反转录,以此为模板用PCR扩增NPY1R基因的cDNA,然后与pET 28a+载体重组,筛选阳性克隆和DNA序列分析鉴定,测序后与GeneBank中NPY1R基因进行同源性比较和序列分析.结果 PER扩增出一个1100 bp左右的DNA片段,与载体重组后DNA序列分析鉴定,DNA序列分析显示克隆的DNA片段是人NPY1R基因,且所克隆的基因共编码384个氨基酸,分子量为44 KD,与GeneBank中NPY1R基因序列同源性达100%.结论 克隆的人NPY1R基因与GeneBank中NPY1R序列完全一致,为进一步应用分子生物学技术深入研究NPY1R与人体肥胖发生、发展及转化等相关作用机制及应用该基因进行其基因蛋白表达奠定了基础.     

吉林汉族人群乙型肝炎肝硬化患病与HLA-DRB1等位基因的关联性

目的：探讨吉林地区汉族人群乙型肝炎肝硬化患病与白细胞抗原（HLA）DRB1区等位基因多态性的关联性。方法：采用PCR-SSP方法对吉林地区汉族61例慢性乙型肝炎,44例乙型肝炎肝硬化患者,32名HBV感染自然恢复者及50名健康献血员作对照进行了HLA-DRB1等位基因分型比较。结果：慢性乙型肝炎组HLA-DRB1＊1201-3等位基因表达频率为17.21%,明显高于正常对照组8.00%（P=0.0427,RR=2.391）；慢性乙型肝炎组与乙型肝炎肝硬化组HLA-DRB1＊0701等位基因频率分别为11.48%,12.50%,明显高于正常对照组2.00%（P=0.0066,RR=6.35；P=0.0046,RR=7.00）及HBV感染自然恢复组1.56%（P=0.0183,RR=8.17；P=0.0136,RR=9.00）；而所检测HLA-DRB1座位的其它等位基因表达频率在四组间无显著性差异（P〉0.05）。结论：吉林地区汉族人群慢性乙型肝炎患病与HLA-DRB1＊1201-3、HLA-DRB1＊0701等位基因型相关联；而乙型肝炎肝硬化患病仅与HLA-DRB1＊0701等位基因型相关联。     

重组人神经肽Y受体Y1融合蛋白的表达、纯化及其生物信息学分析研究

目的 在大肠杆菌中表达人神经肽Y Y1受体,并对之进行纯化、鉴定及生物信息学分析.方法 取已构建好且经测序确认无误的重组质粒pET28a-Y1转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达融合蛋白,并经SDS-PAGE检测和Western Blot鉴定,表达产物包涵体经Ni2+-NTA亲和层析纯化.然后利用相关在线软件进行生物信息学分析Y1受体蛋白.结果 经IPTG诱导含有pET28a- Y1重组质粒的DE3菌,表达出重组人Y1融合蛋白.重组蛋白经Ni2+-NTA亲和层析进行纯化后,得到了较高纯度的融合蛋白.经相关在线软件分析后获得了Y1受体的相关生物学特性.结论 重组质粒pET28a-Y1在大肠杆菌DE3中成功表达,亲和层析纯化后获得较高纯度融合蛋白,并对Y1受体蛋白的生物学特征进行了预测,为进一步研究其生物学功能及其抗体的研制奠定了基础.     

人CDK4 cDNA克隆和原核表达

目的 从人肝癌组织细胞中克隆人CDK4基因和原核表达CDK4蛋白.方法 用逆转录PCR方法从人肝癌组织RNA中扩增出CDK4 cDNA,然后与T载体和PET28a＋载体重组,转化受体菌和诱导表达,DNA序列分析和Western blot鉴定重组质粒和蛋白表达.结果 PCR扩增出900 bp的DNA片段,与T载体和PET28a＋载体重组得到人CDK4基因的重组质粒,DNA序列显示为人CDK4的cDNA全序列;IPTG可以诱导重组菌表达蛋白;Western blot结果表明为人CDK4蛋白.结论 用逆转录PCR方法扩增出人CDK4 cDNA,并与PET28a＋载体重组得到能够用IPTG诱导表达的人CDK4蛋白.     

人细胞周期蛋白依赖性激酶2(CDK2)基因克隆和原核表达

目的从人胃癌组织中克隆出人CDK2基因和原核表达CDK2蛋白.方法从胃癌组织中提取RNA,逆转录PCR扩增CDK2 cDNA'PCR产物进行TA克隆和DNA序列分析;阳性TA克隆CDK2片段亚克隆入PET28a 载体,IPTG诱导表达人CDK2.结果逆转录PCR扩增出约900 bp的DNA片段,TA克隆和DNA序列分析显示重组片段是人CDK2基因序列,全长897bp;CDK2 cDNA亚克隆入PET28a 载体NcoI和XhoI位点之间;IPTG诱导出约34 kD的蛋白.结论从人胃癌组织中成功地扩增出人CDK2基因,并且在大肠杆菌中得到表达.     

糖尿病大鼠心肌GluT4 mRNA的表达水平

目的 探讨ＧｌｕＴ４ｍＲＮＡ的表达水平与糖尿病心肌病的相关性。方法 采用逆转录聚合链式反应的方法对链脲佐菌素（ＳＴＺ）诱导的糖尿病大鼠心肌ＧｌｕＴ４ｍＲＮＡ的表达水平检测与正常对照组大鼠对比。结果 糖尿病大鼠心ＧｌｕＴ４ｍＲＮＡ的表达水平明显低于正常对照组（Ｐ〈０．０１）。结论 在发生糖尿病的同时,大鼠心肌细胞ＧｌｕＴ４ｍＲＮＡ的表达受抑制,含量降低,导致心肌的能量代谢紊乱,引起糖尿病心肌病。     

CD200基因重组质粒延长异基因小鼠皮肤移植物存活的实验研究

目的:利用小鼠同种异体皮肤移植模型,观察重组基因CD200的抗排斥作用。方法:用肌肉注射并电转染的方法,将pcDNA3-CD200基因重组质粒100μg转染到受者BALB/c小鼠体内,同日进行皮肤移植,记录移植皮片的存活时间,采用RT-PCR和免疫荧光的方法检测CD200基因在受者体内的转录和表达,用HE染色观察移植皮片组织病理改变情况。用MTT法检测受鼠对供鼠及第三方供鼠的单向混合淋巴细胞反应(MLR)。结果:RT-PCR和免疫荧光检测表明,肌肉注射并电转染pcDNA3-CD200基因重组质粒后,可在肌肉组织中检测到CD200基因的转录和表达。空白对照组移植皮片平均存活时间为(8·67±1·75)天,pcDNA3空质粒组移植皮片平均存活时间为(8·00±1·55)天,pcDNA3-CD200组小鼠移植皮片平均存活时间为(11·78±1·86)天,移植皮片的存活时间显著延长(P<0·05);pcDNA3-CD200组移植皮片内浸润的炎细胞数量明显减少;MLR检测表明pcDNA3-CD200组的BALB/c小鼠对C57BL/6供鼠的MLR明显低于空白对照组(15天时0·11±0·02低于0·19±0·03,P<0·05),对第三供鼠的MLR也相似。结论:肌肉注射并电转染pcDNA3-CD200基因重组质粒可在小鼠体内大量转录和表达并延长了皮肤移植物的存活时间,减少移植物内炎细胞浸润,降低混合淋巴细胞反应,具有显著的抗排斥作用。     

双歧杆菌BB12对肠炎沙门氏菌诱导Caco-2细胞分泌IL-8 的影响

目的：体外研究双歧杆菌对肠炎沙门氏菌诱导Caco-2细胞分泌IL-8的影响。方法：建立双歧杆菌、肠炎沙门氏菌和结肠癌上皮细胞系Caco-2细胞共培养，逆转录PCR和实时荧光定量PCR和EMSA等方法检测细胞内IL-8mRNA和NF-κBp65，ELISA法检测培养上清中IL-8。结果：对照组的Caco-2细胞低表达IL-8mRNA，细胞核中很难检测出NF-κBp65，培养上清中IL-8的质量浓度为126ng／L。经肠炎沙门氏菌刺激后，IL-8mRNA和NF-κBp65以及培养上清中IL-8的质量浓度（536ng／L）明显高于对照组（分别为P〈0．01，P〈0．01和P〈0．01）。双歧杆菌和肠炎沙门氏菌共培养的Caco-2细胞中，IL-8mRNA和NF-κBp65以及培养上清中IL-8质量浓度（336ng／L）显著低于肠炎沙门氏菌组（分别为P〈0．01，P〈0．01和P〈0．01）。结论：双歧杆菌能明显抑制肠炎沙门氏菌诱导Caco-2细胞IL-8的分泌．其调节方式是抑制NF-κB065的活化．     

压电免疫传感器用于人胸苷激酶及其与单克隆抗体反应亲和常数的测定

目的用自制单克隆抗体构建人胸苷激酶(hTK)压电免疫传感器,测定免疫反应亲和常数,评价抗体的活性。方法在压电石英晶体的金电极上自组装一层蛋白A,定向固定hTK单克隆抗体,测定不同浓度hTK引起的频移值。结果根据Scatchard绘图法,对免疫反应亲和常数进行了估算,为1.85×106mol/L。结论该压电免疫传感器可直接测定溶液中的hTK,得到免疫反应的亲和常数,并证实实验室制备的单克隆抗体具有较高活性。