人呼吸道合胞病毒北京地区A亚型ON1基因型地方株感染A549细胞转录组学分析

目的应用转录组测序方法, 分析北京地区人呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus, RSV)A亚型优势流行基因型ON1地方株感染A549细胞后差异表达基因, 为RSV防治提供潜在靶点。方法选用已经过全基因组测序确定为RSV A亚型ON1基因型的地方株(61397-ON1)感染A549细胞, 提取总mRNA, 通过转录组测序筛选出与未感染的A549细胞为对照的差异表达基因, 对其进行GO分析、KEGG通路分析, 同时随机选择6个差异表达倍数大于2倍的基因进行qRT-PCR验证。结果以未感染的A549细胞为对照, 筛选出1 632个差异表达基因, 其中807个基因表达上调, 825个基因表达下调。差异基因主要参与细胞因子反应以及MAPK级联反应正向调控等免疫应答相关生物过程, 并在MAPK信号通路、NOD样受体信号通路、p53信号通路、TNF信号通路、IL-17信号通路及NF-κB信号通路发生了富集。选择的6个差异表达基因qRT-PCR验证结果与转录组数据趋势一致。结论 RSV A亚型ON1基因型毒株感染A549细胞后的差异表达基因主要参与细胞因子应答及免疫相...     

改进探针标记法斑点杂交在轮状病毒VP7分型中的应用

目的建立一种更加简便的A组人轮状病毒（HRV）核酸斑点杂交VP7分型方法,以便用于对HRV流行情况进行调查。方法在HRV VP7编码基因各G基因型间高度变异而型内高度保守区域设计分型探针,在该区域的两侧相对保守区域设计一对通用引物,利用PCR分别将地高辛标记HRV 5种常见型别（G1～4,G9型）的DNA探针,建立基于VP7的斑点杂交方法;选取经抗原检测和聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）检测均为HRV阳性的2006至2008年住院腹泻患儿粪便标本200份,RT-PCR扩增VP7全基因,并对扩增阳性产物应用斑点杂交方法进行G型别分析。结果建立的斑点杂交方法在5种型别探针间无交叉反应,各型探针的检测灵敏度可达到10 pg。200份PAGE阳性标本中162份RT-RCR扩增VP7基因阳性,斑点杂交显示G1型41例(25.3%),G2型2例(1.2%),G3型63例(38.9 %),G9型35例(21.6%),混合感染19例（11.7%）,杂交未分出型2例(1.2%),未检测到G4型HRV。结论本研究所建立的斑点杂交方法敏感度和特异度强,适合在HRV大规模分子流行病学调查时应用。通过该方法的初步应用,发现北京地区婴幼儿HRV除了常见的G1、G2和G3型外,还有G9型感染。     

儿童呼吸道合胞病毒感染诊断、治疗和预防专家共识

呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV)是世界范围内引起5岁以下儿童急性下呼吸道感染(acute lower respiratory tract infections,ALRTI)最重要的病毒病原[1]。RSV感染是造成婴幼儿病毒性呼吸道感染住院的首要因素,严重危害儿童健康,尤其对早产儿、患有先天性心脏病或原发免疫缺陷的婴幼儿造成的疾病更重。目前,尚无RSV疫苗及有效的抗病毒药物用于RSV的治疗,唯一可用于RSV预防的人源化特异性抗体帕利珠单抗(Palivizumab)尚未引进国内临床应用。临床上在RSV的流行、致病机制、诊断、治疗及预防等方面尚存在一些不足,为进一步规范儿童RSV感染的诊断、治疗及预防,以国内外RSV最新研究进展为参考,特制定此专家共识。     

新型人冠状病毒NL63膜蛋白(M)基因的序列分析及其抗原表位预测分析

目的了解新发现的、与北京地区婴幼儿急性呼吸道感染相关的人冠状病毒HCoV-NL63的主要结构蛋白——膜蛋白（M）的基因特征。方法分别从2份已确认为HCoV-NL63阳性的、取自急性呼吸道感染患儿的标本（BJ3140和BJ8081）中用RT-PCR方法扩增得到其M蛋白的全基因，在对其进行了序列分析的基础上对推导出的M蛋白的抗原表位进行了预测分析。结果BJ3140和BJ8081的M蛋白编码基因全长681bp，编码一个含226个氨基酸的蛋白。BJ3140和BJS081之间M基因的核苷酸和氨基酸同源性分别为99．1％和99．6％；与HCoV-NL63原型株有很高的核苷酸（99．1％～99．7％）和氨基酸同源性（99．6％和98．7％），而与HCoV-229E的氨基酸同源性为61．3％，与HCoV-OCA3和SARS-CoV氨基酸同源性则低于31．0％。BJ3140和BJS081的M蛋白N端21个氨基酸位于病毒包膜外区，随后是3次跨膜区，最后是较长的包膜内区。不同方法的预测结果显示BJ3140的M蛋白的B细胞表位优势肽段多位于C-末端包膜内区域。结论从北京地区婴幼儿HCoV-NL63感染阳性的呼吸道标本中扩增得到的M蛋白编码基因与HCoV-NL63原型株有很高的同源性，具有与其他冠状病毒M蛋白相似的结构特征。     

北京地区婴幼儿急性呼吸道感染与新近报道的人细小病毒相关性的初步研究

目的了解北京地区婴幼儿急性呼吸道感染与新近报道的人细小病毒（human bocavirus,HBoV）的关系.方法选择2003年11月至2004年2月收集的经间接免疫荧光和/或病毒分离排除了常见呼吸道病毒感染的急性呼吸道感染患儿标本319例,应用针对HBoV的NP1基因的PCR引物进行HBoV基因片段检测,随机选取HBoV基因检测阳性标本中的5例,对其PCR扩增产物直接进行核苷酸序列测定.将所测到的序列与GenBank中的基因序列进行比较分析.结果319例标本中HBoV基因检测阳性的为13例,其阳性检出率占本组检测标本的4.1%;HBoV阳性检出率在本组的毛细支气管炎患儿中最高,达10.9%（5/46）,其次为支气管炎患儿（6.3%,2/32）;HBoV检测阳性标本的患儿年龄主要分布于5个月～5岁,尤其是＜1岁的患儿;其中6～7个月的患儿中HBoV检测阳性的占50%（2/4）,9～10个月的患儿中阳性的占25%（2/8）,其次为5～6个月的患儿（18.2%）、11个月～1岁的患儿（14.3%）及8～9个月的患儿（12.5%）;在＜5个月的总计103例患儿中以及＞5岁的28例患儿中均未检测到HBoV阳性标本;基因序列分析表明,本研究中5例北京的HBoV之间基因序列的同源性在99.7%～100%之间;与st1、st2株的同源性为99.2%～99.4%.结论本研究结果提示北京地区部分儿科患者的急性呼吸道感染与HBoV有关,且HBoV感染在低年龄组儿童中更为常见.     

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目的分析婴幼儿呼吸道合胞病毒(RSV)感染与鼻咽分泌物嗜酸性粒细胞的关系,探讨呼吸道病毒感染对过敏及喘息发生的影响。方法选择2002—2004在首都儿科研究所就诊的呼吸道疾病婴幼儿223例,包括肺炎组82例,毛细支气管炎组65例,反复喘息组76例。取患儿鼻咽分泌物,分离培养RSV等7种较常见病毒,并检测嗜酸性粒细胞,进行对比分析。结果3组间病毒检测阳性率不同(P<0·05),RSV检测阳性率差异存在显著性意义(P<0·01);3组患儿鼻咽分泌物嗜酸性粒细胞计数不同(P=0·000),反复喘息组高于毛细支气管组及肺炎组(均P<0·01)。结论RSV是婴幼儿毛细支气管炎、反复喘息和肺炎的主要病原。RSV等病毒感染并不促使过敏的发生。     

北京市2001-2003年3141例儿科急性呼吸道感染中副流感病毒的研究

目的探讨应用传代狗肾细胞（MDCK细胞）进行副流感病毒（PIV）的分离,了解近年来北京地区儿科急性呼吸道感染中PIV的感染状况.方法收集2001年1月至2003年12月急性呼吸道感染患儿的临床标本3141例,应用微量细胞培养法比较MDCK细胞与传代猴肾细胞（Vero细胞）用于分离PIV的敏感性;所有标本接种于MDCK细胞,结合血凝试验及间接免疫荧光法进行PIV检测.结果 Vero细胞PIV分离阳性的标本在MDCK细胞中也得到阳性结果;3141例标本中PIV阳性94例（3.0%）.1191例上呼吸道感染患儿标本中PIV135例（2.9%）,PIV311例（0.9%）;1634例下呼吸道感染患儿标本中PIV115例（0.9%）,PIV3 24例（1.5%）;207例支气管哮喘患儿标本中PIV阳性3例（1.4%）;38例发热患儿中PIV阳性1例;71例其他标本中PIV阳性5例.结论利用MDCK细胞可进行PIV的分离;北京地区儿科急性呼吸道感染中PIV感染是原因之一.     

中国呼吸道合胞病毒地方株G蛋白在重组痘苗病毒中的表达

目的　构建表达中国呼吸道合胞病毒 (RSV)地方株G蛋白基因的重组痘苗病毒 ,以用于RSV感染防治的研究。方法　用基因克隆技术将中国RSV地方株G蛋白基因插入到痘苗病毒载体中 ,与痘苗病毒共感染获得重组病毒。用免疫印迹、ELISA、蚀斑减少试验等方法检测表达产物的免疫原性及生物活性。结果　RSV地方株G蛋白在痘苗病毒中获得较好的表达 ,表达产物的糖基化程度较高 ,且该重组病毒免疫家兔可诱发特异性抗体产生。蚀斑减少试验证明 ,用该表达产物制备的抗血清具有中和病毒的活性。结论　重组病毒表达的中国RSV地方株G蛋白具有较好的抗原性、免疫原性等生物活性     

聚合酶链反应技术在无菌性脑膜炎和脑炎病原诊断中的应用探讨

目的　提高无菌性脑膜炎和脑炎病原早期诊断的敏感性和特异性。方法　分别设计针对肠道病毒(EV) 5’UTR、Ⅰ型和Ⅱ型单纯疱疹病毒 (HSVⅠ ,Ⅱ )糖蛋白D基因、人巨细胞病毒 (CMV)立即早期蛋白基因、EBV核抗原 1基因和肺炎支原体 (MP)ATPase操纵子基因的巢式PCR引物 ,应用巢式 聚合酶链反应 (nested PCR)技术检测无菌性脑膜炎和脑炎患儿的脑脊液标本中EV、Ⅰ型和Ⅱ型HSV、CMV、EBV及MP。结果　所用不同病原体的引物之间无交叉反应 ,特异性高。收集到的 15 8例脑脊液标本中有 10 2例 (6 4 6 % )检测到病原 ,包括 4 2例EV (42 / 15 8,2 6 6 % ) ,2 7例HSVⅡ (2 7/ 15 8,17 1% ) ,16例EBV (16 / 15 8,10 1% ) ,8例MP(8/ 15 8,5 1% ) ,6例CMV(6 / 15 8,3 8% ) ,3例HSVⅠ (3/ 15 8,1 9% )。这些阳性标本中有 10例检测到 2种或 3种病原。结论　PCR技术在无菌性脑膜炎和脑炎病原的早期诊断中有潜在的应用价值 ,可在中枢神经系统感染的病原鉴别中作为一种辅助性实验室诊断为临床诊治提供参考依据。     

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目的初步了解肠道病毒(EV)在小儿急性呼吸道感染(ARI)中的流行概况。方法2003-09—2005-04,于首都儿科研究所就诊的815例ARI患儿,取其鼻咽深部分泌物,用病毒分离及逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法检测EV,用病毒分离和间接免疫荧光法检测呼吸道合胞病毒(RSV)等7种呼吸道病毒。取144例患儿双份血清,用酶联免疫吸附试验检测EV抗体。结果病毒总检出率50.9%,RSV阳性率最高(24.9%),其次为EV(16.9%)。EV在不同月份阳性率为0~34.2%,冬季阳性率最低。RT-PCR、双份血抗体检测和病毒分离3种检测EV方法的阳性率分别为16.2%、7.6%和1.0%。332例急性喘息患儿中,EV阳性率20.8%,仅次于RSV(42.5%);3岁以上喘息患儿中,EV阳性率最高(33.9%),而3岁以下患儿中,RSV阳性率最高(48.7%)。结论在住院ARI患儿中,EV是仅次于RSV的常见病原,也是引起小儿急性喘息性疾病的主要病原之一。EV在年长儿中阳性率相对较高,冬季阳性率较低。RT-PCR法检测EV,快速、敏感、特异,可用于小儿EV感染的诊断。