大剂量化疗、自体外周血干细胞移植、生物治疗、长间歇维持化疗序贯治疗急性白血病的临床观察

目的观察大剂量化疗、自体外周血干细胞移植、生物治疗、长间歇维持化疗序贯治疗急性白血病的临床疗效。方法自2001年3月~2009年12月对第三军医大学新桥医院69名急性白血病患者进行大剂量化疗、自体外周血干细胞移植、白介素-2(IL-2)生物治疗、长间歇维持化疗序贯治疗,其中,急性淋巴细胞白血病(ALL)40例,急性髓细胞白血病(AML)29例,观察临床疗效和并发症。结果除1例ALL外,68名患者移植后造血功能均快速重建。急性淋巴细胞白血病首次完全缓解(ALL-CR1)25例,其中无病存活17例,带病存活2例,死亡6例,急性淋巴细胞白血病再次完全缓解(ALL-CR2)15例,其中无病存活3例,带病存活3例,死亡9例;急性髓细胞白血病首次完全缓解(AML-CR1)17,其中无病存活10例,带病存活2例,死亡5例,急性髓细胞白血病再次完全缓解(AML-CR2)12例,其中无病存活5例,带病存活1例,死亡6例。结论该序贯疗法治疗急性白血病安全有效,CR1患者较CR2患者疗效更好。     

外周血干细胞移植患者骨髓基质细胞形态学改变的观察

目的：进一步探讨外周血干细胞移植后患者骨髓造血微环境损伤的机理。方法：采用光镜、扫描电镜和透射电镜观察外周血干细胞移植患者在单纯化疗或放化疗结合预处理前后骨髓基质细胞的形态变化。结果：①光镜和扫描电镜：与预处理前骨髓基质细胞相比，单化组和放化组出现不同特征的形态学变化；②透射电镜观察：放化组骨髓基质细胞的内质网扩张，线粒体基质变淡，嵴消失；单化组基质细胞的线粒体重度退行性变，结构紊乱。结论：外周血干细胞移植患者经单化或放化预处理后骨髓基质细胞形态的改变可能是导致造血微环境损伤的重要原因之一。     

血液病患者/健康供者外周血造血干细胞动员及采集效果分析

目的探讨外周血造血干细胞(PBSC)动员采集的方法及其效果。方法对恶性血液病(多发性骨髓瘤、急性白血病和淋巴瘤)患者及健康供者经单一粒细胞集落刺激因子(G-CSF)和化疗联合粒细胞集落刺激因子方案动员后,使用血细胞分离机采集外周血造血干细胞,分析不同动员方案、疾病、年龄、性别及供者的动员采集。结果所有患者和健康供者均成功动员和采集到了PBSC(MNC>5×108/kg,CD34+>2×106/kg);健康供者的动员效果为MNC(8.25±3.07)×109/L;恶性血液病患者中,急性髓细胞白血病患者采集所获得的MNC最多,为(7.48±2.62)×108/kg,多发性骨髓瘤患者最差,为(5.06±1.50)×108/kg;急性淋巴细胞白血病患者采集所获得的CD34+最多,为(5.36±2.64)×106/kg,多发性骨髓瘤患者最少,为(3.45±0.76)×106/kg。化疗联合G-CSF和IL-11为最好的动员方案;18—60岁患者采集效果最好,60—65岁患者最差;男性较女性好。结论健康供者较恶性血液病患者动员效果好,健康供者中性别对采集效果无影响;无论是健康供者还是恶性血液病患者,动员、采集过程副作用小。     

不同培养体系培养人脐血源基质细胞的探索性研究

目的 探索不同培养体系对人脐血源基质细胞原代培养的影响，并观察人脐血源基质细胞的生物学特性。方法 取产科胎儿脐带血，采用经典和改良Dexter培养体系培养人脐血源基质细胞。倒置显微镜动态观察细胞生长情况，瑞氏染色观察细胞形态特征，采用细胞化学和免疫细胞化学进行鉴定。结果 改良Dexter培养体系在48 h细胞贴壁数、细胞开始伸展时间及原代培养时间明显优于经典Dexter培养体系。原代培养9-14天(平均12.1天)时贴壁细胞集落开始形成，15-21天(平均19.4天)时集落数量最多，培养28天贴壁细胞铺满培养皿底，细胞类型以成纤维样细胞、巨噬样细胞、“小圆”类细胞为主。细胞化学染色显示：非特异性酯酶染色法(NSE)显示阳性，阳性率100％；过氧化物酶染色法(POX)显示阴性；糖原染色(PAS)显示阳性，阳性率为100％；碱性磷酸酶(ALP)染色显示部分阳性，阳性率26％。免疫细胞化学染色显示：CD31显示阳性率为96％，CD68显示阳性率为95％，CD45阴性，Fn显示阳性率94％。结论 改良Dexter培养体系是一种理想人脐血源基质细胞培养体系，人脐血源基质细胞在体外的成功培养为从一新的角度进一步研究其在临床的早日应用提供理论基础。     

探讨非霍奇金淋巴瘤骨髓实验诊断体系的临床应用价值

目的：探讨联合多种检测技术的骨髓实验诊断体系诊断非霍奇金淋巴瘤骨髓浸润的价值。方法以骨髓涂片检查、切片检查、流式细胞术、荧光原位杂交技术和染色体核型分析技术为基础,建立骨髓实验诊断体系。体系内容包括实验流程和诊断结果评价体系。实验流程的检验顺序为：（1）骨髓涂片、骨髓切片;（2）FCM分析和染色体培养分析;（3）FISH探针检测。诊断结果评价体系以骨髓涂片（BMA）和病理切片（BMB）作为定性诊断指标,特异性的FCM或免疫组织化学（IHC）的免疫表型和FISH探针的基因表型作为分型依据。CAA结果作为诊断及预后判断指标。各项检测技术的实验操作按常规进行。结果总例数为115例,BMA和BMB完成检查各115例,FCM完成74例,FISH 85例,CAA 23例。各单项检出阳性率分别为BMA 72.17%,BMB 89.96%,FCM 90.54%,FISH 54.12%。实验诊断体系综合分析检出率为100%。单项比较,BMB和FCM的阳性检出率明显高于BMA和FISH,差异显著。将75例淋巴结病理确诊为NHL患者的诊断结论在定性、免疫分型和病理分型3个层面上,做骨髓实验诊断结果与淋巴结病理诊断结果的对比分析,其吻合率分别为98.67%,91.94%,72.00%,说明骨髓诊断NHL在较精准的病理分型水平上还有差距。结论骨髓实验诊断的各单项技术对NHL-BMI的诊断有其临床价值,也有不足和局限。骨髓涂片和骨髓切片检查是基本方法,可以做出定性诊断。进一步做 FCM 或 IHC 可以明确免疫分型,配合FISH及CAA可以得到精细的病理分型诊断。多技术联合应用的实验诊断体系是诊断NHL的有效方法,可以提高NHL-BMI的诊断正确性和阳性率。     

预判急性白血病患者Auto—PBSCT动员、采集效果影响因素的临床研究

目的：探讨急性白血病患者外周血干细胞动员、采集的效率及影响因素。方法对37例急性白血病患者经化疗＋生长因子动员,动员第5～10天,当外周血WBC＞5×109/L,CD34＋＞20个/μl时,使用CS-3000 Plus血细胞分离机（Baxter公司）进行外周血干细胞采集;采集前外周血WBC分类单个核细胞（MNC,包括幼稚细胞、淋巴细胞及单核细胞）,计算MNC%×WBC计数＞（4～6）×109/L预计需要采集循环血容量。分析不同化疗动员时机、疾病、年龄、性别的动员采集,并对采集前外周血进行白细胞计数、分类以及干细胞采集物进行WBC计数、分类和CD34＋检测。结果所有患者均成功动员和采集到了外周血干细胞（MNC＞6×108/kg,CD34＋＞2×106/kg）,并成功造血重建。急性髓细胞白血病患者采集所获得的 MNC 与急性淋巴细胞白血病患者采集获得无明显差异;但急性淋巴细胞白血病患者采集获得CD34＋细胞明显较多（P＝0.015）;动员时机的化疗病程与采集物的CD34＋细胞呈负相关,动员时机≤3个疗程与≥6个疗程比较,前者CD34＋细胞明显较好,具有统计学差异（P＝0.028）;外周血MNC数值与采集物MNC及CD34＋细胞具有相关性（r＝0.600,P＝0.00;r＝0.510,P＝0.001）。结论根据不同的疾病、性别、年龄,采用不同的动员采集方案,一般可以成功采集。外周血 MNC 数值对采集物中 CD34＋细胞的总量具有一定预测意义。     

白血病成骨细胞屏蔽共培养AML细胞化疗杀伤作用的研究

目的探讨白血病成骨细胞对急性髓性白血病(AML)细胞屏蔽化疗杀伤的作用,及其与促血小板生成素/血小板生成素受体(TPO/c-MPL)信号通路的关系。方法分离培养白血病骨髓间充质干细胞并行成骨诱导,ELISA法检测成骨细胞分泌血小板生成素(TPO)水平,流式细胞仪检测人红白血病细胞株(HEL)c-MPL表达。成骨细胞与HEL细胞共培养,观察在化疗药物柔红霉素干预下HEL细胞存活率。结果白血病骨髓成骨细胞培养d7、d14 TPO表达分别为(176.84±15.32)ng/mL和(198.24±13.49)ng/mL,明显高于正常对照的TPO水平,分别为d7(140.13±20.12)和d14(157.66±18.82)ng/mL。应用柔红霉素干预后,AML成骨细胞与HEL细胞共培养组半抑制浓度(IC50)为(3.320±0.218)μg/mL,高于HEL+正常来源成骨细胞组(2.236±0.167)μg/mL和HEL+hFOB1.19组(2.254±0.111)μg/mL。生长曲线研究发现,在不同浓度DNR干预下,AML成骨细胞与HEL细胞共培养组中HEL细胞的细胞存活率最大,均高于其他HEL共培养组。结论白血病成骨细胞能有效屏蔽化疗药物对白血病细胞的杀伤作用,这种作用可能与白血病骨髓微环境内TPO/c-MPL信号通路相关。     

异基因外周血干细胞移植治疗急性和慢性白血病52例临床观察

目的:评价异基因外周血干细胞移植(Allo-PBSCT)治疗血液肿瘤的疗效。方法:用Allo-PBSCT治疗血液肿瘤患者52例[急性淋巴细胞白血病(ALL)11例,急性髓系白血病(AML)12例,慢性粒细胞白血病(CML)29例]。预处理方案为含TBI(21例)与不含TBI的高剂量化疗方案(31例),采用环孢素加骁悉加甲氨喋呤(MTX)常规预防性控制移植物抗宿主病,非亲缘关系移植加用抗胸腺细胞球蛋白(ATG)。结果:52例患者移植后造血功能均重建,急性移植物抗宿主病(aGVHD)发生率23.1%,慢性移植物抗宿主病(cGVHD)发生率21.2%,其中局限型占15.4%;9例患者于移植后1～16月分别死于移植物抗宿主病、感染和疾病复发或进展,35例患者已PFS3～46个月,ALL-首次完全缓解(CR1)9例,无病存活(DFS)5例,带病生存2例,死亡2例,ALL-不缓解(NR)2例,死亡2例;AML-CR18例,DFS6例,带病生存2例,AML-CR24例,DFS2例,带病生存1例,死亡1例;CML(慢性期)22例,DFS19例,带病生存2例,死亡1例,CML(加速期)4例,DFS2例,带病生存1例,死亡1例,CML(急变期)3例,DFS1例,死亡2例。结论:异基因外周血干细胞移植是目前有可能治愈血液肿瘤的惟一方法。CML慢性期和急性白血病CR1后尽早选择异基因造血干细胞移植。     

特异性RNA干扰阻抑骨髓基质细胞SDF-1表达对Jurkat细胞黏附及药物敏感性的影响

目的观察特异性RNA干扰(RNA i)阻抑急性白血病骨髓基质细胞衍生因子-1(SDF-1)表达对共培养的急性白血病细胞系Jurkat细胞黏附及药物敏感性的影响。方法脂质体介导SDF-1特异性RNA i质粒转染培养的急性白血病患者骨髓基质细胞,G418筛选阳性混合克隆,ELISA法检测SDF-1表达;Jurkat细胞与之共培养,通过细胞计数计算黏附率,MTT法检测对阿霉素的药物敏感性。以未转染急性白血病骨髓基质细胞及正常骨髓基质细胞作为对照。结果转染阳性克隆组、未转染急性白血病组及正常对照组骨髓基质细胞培养上清SDF-1水平分别为每周(1920±205)pg/105细胞、(12 370±1355)pg/105细胞和(6620±770)pg/105细胞;与之共培养的Jurkat细胞黏附率分别为(28.8±2.6)%,(57.4±3.8)%和(45.2±4.0)%,阿霉素50%抑制浓度分别为585,6162,1758 nmol/L。结论RNA i阻抑SDF-1表达的骨髓基质细胞使Jurkat细胞黏附减少,对阿霉素的敏感性增加。     

全反式维甲酸对外周血干细胞移植患者骨髓基质细胞黏附分子表达及黏附力的影响

本研究探讨全反式维甲酸（all—transretinoic acid，ATRA）能否促进外周血造血干细胞移植（peripheral blood stem cell transplantation，PBSCT）预处理致伤的骨髓基质细胞（bonemarrow stromal cells，BMSC）功能的恢复。用流式细胞术检测27例造血干细胞移植患者预处理前后BMSC表面细胞间黏附分子-1（intercellular adhesion molecule—1，ICAM-1）和血管黏附分子-1（vascular adhesion molecule-1，VCAM-1）表达，用放射免疫法测定BMSC培养上清液中可溶性ICAM—1（sICAM-1）水平以及BMSC对CD34^＋细胞的黏附率，并检测浓度分别为0、01、0．1、1μmol/L的ATRA作用后上述指标的动态变化。结果显示：PBSCT预处理后，BMSC表面ICAM-1和VCAM-1的表达以及BMSC培养上清液中sICAM-1的表达水平降低，BMSC对CD34^＋细胞黏附率降低，而在ATRA作用后，BMSC表面ICAM—1表达增加，培养上清液中sICAM-1水平升高，BMSC对CD34^＋细胞的黏附率增加．但VCAM-1表达变化不明显。结论：全反式维甲酸可部分修复受损的BMSC的黏附功能，有助于促进骨髓造血重建。