大鼠SOCS3基因重组腺病毒载体的构建及转染血管平滑肌细胞后的表达

目的 构建携带大鼠SOCS3基因的重组腺病毒载体并转染大鼠血管平滑肌细胞,评价其转染效果,为血管增殖性疾病转基因治疗的实验研究奠定基础.方法 用BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ将目的基因pUC57-Simple-rSOCS3及腺病毒穿梭载体pYr-adshuttle- 4(带GFP标记)行双酶切.回收酶切质粒的目的片段进行连接,产物转化至DH5α感受态.提取质粒酶切鉴定正确后测序.通过LR体外同源重组将rSOCS3表达框构建至pAd/PL-DEST腺病毒表达载体上.将腺病毒线性化后转染HEK293细胞包装腺病毒,PCR鉴定此腺病毒中是否含有rSOCS3基因.放大培养并收集病毒,TCD法测定病毒滴度.将此病毒感染大鼠血管平滑肌细胞,荧光显微镜观察感染效率,real-time PCR及免疫印迹检测SOCS3 mRNA及蛋白表达.结果 rSOCS3腺病毒穿梭质粒酶切鉴定正确,测序与rSOCS3基因库中的序列完全相符.PCR鉴定pAd/PL-DEST腺病毒表达载体成功携带目的基因rSOCS3.TCD法测定的最终滴度为2×1010pfu/mL.荧光显微镜观察此病毒感染血管平滑肌细胞的效率在80％以上,real-time PCR及免疫印迹检测结果显示血管平滑肌细胞中SOCS3 mRNA及蛋白表达明显上调.结论 成功构建携带大鼠SOCS3基因的腺病毒载体,并在血管平滑肌细胞中高表达,为血管增殖性疾病转基因治疗的实验研究奠定了基础,具有一定的应用价值.     

大鼠静脉移植物的组织因子表达

背景:已有研究显示在动脉球囊损伤模型中,动脉中层平滑肌受损后组织因子表达迅速上调,缺血再灌注损伤也会导致内皮细胞组织因子表达增加.而对于静脉移植物中组织因子表达及其机制的研究较少.目的:观察静脉移植物管壁组织因子表达变化.设计、时间及地点:动物观察性实验,于2006-05/2008-05在华中科技大学同济医学院附属协和医院心血管外科实验室完成.材料:SD 大鼠30 只.方法:于颈内、颈外静脉汇合处结扎颈外静脉近心端,颈外静脉远心端在发出分支前结扎离断.以无损伤血管夹夹闭颈总动脉近心端和远心端,在两血管夹中间斜形切除5 mm动脉.将动脉近心端和静脉远心端吻合两针并对抗牵引,再在两针之间的前后壁分别缝合三针;离断颈外静脉近心端,将其和颈总动脉远心端吻合.主要观察指标:免疫组织化学观察管壁组织因子、增殖细胞核抗原表达,同时检测标本蛋白抽提物组织因子活性,使用计算机图像分析系统分析内膜、中膜厚度,以对侧颈外静脉作为对照.结果:所有静脉移植物血管外膜均有组织因子表达,早期静脉移植物内膜、中膜组织因子表达明显增加,晚期静脉移植物内膜、中膜无组织因子表达;对照静脉内膜、中膜无组织因子表达.术后3 d静脉移植物可观察到细胞增殖核抗原蛋白阳性表达,7 d明显增高,14 d达到最高.对照组静脉、早期和晚期静脉移植物血管蛋白抽提物组织因子活性无统计学意义.静脉移植物内膜在术后7,14,28 d增生明显,中膜在术后14,28 d增生明显.结论:不同时间点静脉移植物管壁组织因子表达变化与新内膜增生相关.     

聚乙二醇-海藻酸钠水凝胶构建新型组织工程瓣膜支架

目的 利用聚乙二醇-海藻酸钠水凝胶交联去细胞瓣膜构建组织工程瓣膜支架,并研究其生物学和生物力学性能.方法 由聚乙二醇-海藻酸钠水凝胶交联去细胞瓣膜制备复合支架瓣膜,由戊二醛与瓣膜交联制备戊二醛交联瓣膜,通过组织学染色,扫描电镜,细胞增殖实验,生物力学测试研究复合支架瓣膜的生物学以及生物力学性能,并与戊二醛交联瓣膜进行比...     

一期大动脉调转术的主要问题及对策

目的 总结一期大动脉调转术(ASO)治疗完全性大动脉转位(TGA)存在的主要问题并探讨其应对策略.方法 对 2006 年 5 月至 2007 年 8 月收治的 14 例患儿实施一期大动脉调转手术.患儿平均年龄(2.6±0.8)个月(0.5～14 个月);平均体重(3.85±1.30)kg(3～9 kg).室间隔完整 TGA(TGA/IVS)12 例,均合并房间隔缺损(ASD),同时合并动脉导管未闭(PDA)11 例;TGA 合并室间隔缺损(TGA/VSD)2 例,均同时合并 PDA 和 ASD.11 例合并中度肺动脉高压,3 例合并重度肺动脉高压,术前均使用前列腺素 E1(PGE1).手术在全麻、中低温、低流量体外循环下完成.在主动脉、肺动脉瓣上方横断,将左右冠状动脉开口移栽至肺动脉近端.经肺动脉分叉下方,吻合肺动脉近端和升主动脉远端.用自体心包修复主动脉近端缺失部分,并在新主动脉开放后吻合主动脉近端和肺动脉远端.结果 3 例 TGA/IVS患儿术后肺部感染,2 例(分别为 13 个月、3 个月)患儿分别于术后 10 h及12 h 突发室颤死亡.未发生与冠状动脉移植相关并发症.术前肺动脉高压患儿,特别是重度肺动脉高压,术后肺动脉压力均明显下降.12 例术后顺利恢复出院.随诊 3～12 个月,全部患儿心功能恢复良好,无远期并发症和死亡.结论 一期大动脉调转手术对于 TGA 有较好早期治疗效果.针对术中主要问题作出适当的手术应对措施,可以获得满意治疗效果.     

用MyD88 siRNA制备半成熟树突状细胞致免疫耐受的实验研究

目的 探讨利用Toll样受体关键蛋白转录水平抑制剂髓细胞样分化标记物（myeloid differentiation marker 88，MyD88）siRNA，制备半成熟树突状细胞（dendritic cell，DC）的表型和致耐受功能。方法 取BALB／c小鼠骨髓接种、培养，加入浓度为10ng／ml的重组小鼠粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（rmGM—CSF）诱导，培养至第8d将DC分为3组，空白对照组：于培养过程中不加其它任何物质；LPS组：加入终浓度为1μg／ml的LPS；实验组：加入MyD88 siRNA4h后，再加入1μg／ml的LPS。采用流式细胞术检测3组DC的表型，用酶联免疫吸附测定（ELISA）检测培养上清的白细胞介素10（IL-10）、白细胞介素12（IL-12）的含量，初次和再次混合淋巴细胞实验检测DC刺激T细胞增殖能力，并观察术后鼠移植心存活时间。结果 空白对照组DC表型为CD11c^＋、CD25、CD40^low、CD80^low、CD86^low和MHC-Ⅱ^low未成熟表型DC，再经LPS刺激后成为成熟表型DC；而实验组DC表型为CD11c^＋、CD25^-、CD40^mid、CD80^low、CD86^low和MHC-Ⅱ^mid。半成熟表型，其IL-10／IL-12比率明显增高；可诱导同种异型T细胞无反应性，并能延长移植心存活时间。结论 MyD88siRNA转染结合LPS刺激可使未成熟DC进一步分化为一种半成熟DC，较未成熟DC拥有更稳定有效的致耐受特性。     

TGF-β1调控组织工程瓣膜力学性能机制研究

目的:采用转化生长因子(TGF-β1)联合肌成纤维细胞构建组织工程心脏瓣膜(TEHV),探讨TGF-β1能否改善TEHV的力学性能及其可能机制。方法:分离培养大鼠肌成纤维细胞,细胞鉴定后种植于去细胞瓣叶支架上。将瓣叶置于含10 ng/ml TGF-β1的培养液中,培养14 d构建的TEHV做为实验组,对照组除培养液中不添加TGF-β1外,其余同实验组。检测两组TEHV的赖氨酰氧化酶(LOX)和羟脯氨酸含量,LOX和Ⅰ型胶原(COLL-1) mRNA表达,以及力学性能。结果:实验组TEHV的LOX和羟脯氨酸含量均高于对照组(P<0.05),LOX和COLL-1 mRNA表达均高于对照组(P<0.05),最大负荷、最大应力均高于对照组(P<0.05),而两组的最大应变和弹性模量的差异无统计学意义(P>0.05)。结论:在体外构建TEHV过程中,通过TGF-β1对肌成纤维细胞的调控作用,可以在基因水平增强细胞COLL-1和LOX mRNA的表达,使得胶原蛋白合成和交联程度增加,从而使TEHV的力学强度增加,力学性能得到改善。     

去端肽胶原介导小干扰RNA抑制大鼠静脉移植物内膜增生

Objective To evaluate the efficacy of using small interfering RNA targeting TF as a therapy for vein graft failure. Methods External jugular vein to carotid artery interposition vein grafts, which were applied to a low flow condition, were made in 120 Sprague-Dawley rats weighing 260 to 300 g. These rats were randomly divided into 4 groups, 30 rats each group. Group A was atelocollagen-TF Stealth<'TM> Select RNAi group. Group B was atelocollagen-TF Stealth<'TM> RNAi group. Group C was atelocollagen group. Group D was control group. Small interfering RNA mixed with atelocollagen was administrated to the external wall of grafted veins. The TF protein expression of vein gratis was analyzed by Western blot at 1, 3, 7, 14, and 28 d postoperatively, and by immunochemistry at 3 d postoperatively. The proliferation index was determined at 14 d postoperatively. Neointimal hyperplasia was evaluated at 28 d postoperatively. BLOCK-iTTM fluorescent oligo was used to confirm its stability and successful transfer into the vein graft wall at 3 and 7 d postoperatively for another group (n = 12). Results Fluorescence of BLOCK-iT<'TM> fluorescent align could be detected in the graft wall even at 7 d postoperatively. Knockdown of the TF expression was achieved by perivascular application of siRNA using atelocollagen. Compared with control group, the intima thickness at 28 d after grafting was significantly reduced (P ＜ 0.05). This phenomenon was preceded by significant reduction of cell proliferation in siRNA-treated grafts at 14 d postoperatively (P ＜0.05). Conclusion The expression of TF in vein grafts can be effectively inhibited by specific siRNAs using a atelocoilagen-based nonviral delivery approach/n vivo, so that the neointimal thickening can be prevented.     

γ-氨基丁酸对中枢和外周血管平滑肌作用的比较

Y一氨基丁酸（GABA）是一种重要的抑制性神经递质，它对脑血管平滑肌的调节作用正日益受到重视。已证明在描、犬和大鼠等动物的脑血管子滑肌上有GABA能神经支配，近来报道在外周血管也有GABA能神经。本文用离体描脑血管（基底动脉）和大鼠网主动脉标本，观察其对不同激动剂所引起的血管收缩作用的影响，以进一步了解GABA对不同血管平滑肌的调节作用。回材料与方法市场购健康猫，体重‘～5kg，雌雄兼用。腹腔注射戊巴比妥销待麻醉后取出脑血管基底动脉段。外周血管以大鼠胸主动脉为标本。其余方法仿文献【l」。待标本稳定后，给予不同…     

RGD肽对天然瓣膜支架细胞黏附性能的影响

精-甘-天冬氨酸(RGD肽)是公认有效的促黏附分子.我们采用化学交联法,使含RGD序列短肽与去细胞瓣共价键合,以直接混合短肽组与单纯去细胞瓣组作为对照,种植大鼠主动脉肌成纤维细胞.MTT试验显示RGD肽固定促进细胞黏附,且12 h内黏附率随时间和肽浓度递增.沉淀法计数和HE染色、扫描电镜检测证明类似结果.因此,RGD肽表面修饰天然瓣膜支架,提高细胞黏附性能,有利于组织工程心脏瓣膜的构建.     

大动脉调转术围手术期处理

目的 总结大动脉调转手术(ASO)围手术期处理方法,提高患儿的手术存活率.方法 2007年1月至2008年3月我科实施ASO术20例.男17例,女3例,年龄14 d～4岁,平均(4.7±3.6)个月.体重3.0～17.0 kg,平均(5.0±3.3)kg.术前诊断包括完全性大动脉转位室间隔完整型(TGA/IVS)14例,完全性大动脉转位合并室间隔缺损(TGA/VSD)5例,右室双出口伴肺动脉瓣下室间隔缺损(Taussig-Bing综合征)1例.结果 住院死亡2例,术后并发症包括低氧血症10例,肺部感染4例,呼吸衰竭二次插管2例,左肺不张1例,房性心律失常1例,室性心律失常1例,伤口愈合不良2例.结论 大动脉调转手术术前应该积极改善患儿缺氧情况,纠正酸中毒,严重缺氧呼吸衰竭者要急诊手术,术后加强左心功能维护,降低肺动脉压力,同时加强呼吸道管理.