转化生长因子β1缓释壳聚糖微球制备及体外的细胞相容性

背景:利用缓释系统释放生长因子,是目前生物活性因子应用研究的方向之一.目的:应用离子交联沉淀法制备壳聚糖-转化生长因子β1缓释微球,观察其体外缓释性能以及细胞相容性.设计、时间及地点:观察性实验,于2006-10/2007-09在华中科技大学同济医学院附属协和医院中心实验室完成.材料:壳聚糖,脱乙酰度90%,由清华人学化学工程系提供:转化生长因子β1,由晶美公司提供;大鼠由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供.方法:①离子交联沉淀法制各壳聚糖微球,并包裹转化牛长因子β1,制备可体外缓释转化生长因子β1 的壳聚糖-转化生长因子β1缓释微球.②选择传代二三次、生长良好的大鼠胸降主动脉中层肌成纤维细胞,调节细胞密度至1 × 108 L-1,分别加入不同浓度(4,2,1 g/L)壳聚糖微球浸提液,不含浸提液的培养基作为对照培养.主要观察指标:扫描电镜、激光粒度分析仪、Elisa法观察微球表面形态,测定药物载药率、包封率、体外缓释效率等指标:阳甲基偶氮唑盐法观察细胞增殖情况,评估壳聚糖微球体外细胞相容性.结果:所得微球球形良好.表面光滑,粒径分布集中,平均粒径272 nm.壳聚糖微球有较高的药物包封率,达80.60%.体外释放试验提示,转化生长因子β1初期存在突释现象,前24 h释放达27%,其后可从壳聚糖微球中稳定释放,7 d累计释放达41%.四甲摹偶氮唑盐法提示该壳聚糖微球对细胞体外生长无不良影响,相容性好.结论:离子交联沉淀法制备壳聚糖缓释微球方法简单易行,所得壳聚糖-转化生长因子β1微球具有良好的缓释效能及细胞相容性.     

转化生长因子β1缓释微球对体外P3/4HB无纺支架细胞生长的影响

目的:研究转化生长因子β2(TGF-β1)壳聚糖缓释微球对体外3-羟基丁酸酯-co-4-羟基丁酸酯(P3/4HB)无纺支架培养肌成纤维细胞的作用.方法:静电纺丝法制备P3/4HB无纺支架,接种大鼠肌成纤维细胞.在实验组培养基中分别加入TGF-β1.缓释微球和TGF-β1,体外培养1周后行扫描电镜观察,检测羟脯氨酸和DNA含量;并用ELISA法动态检测TGF-β1缓释微球缓释效果.结果:TGF-β1可从缓释微球中缓慢释放,1周内微球释放率为40.6%.与对照组比较,实验组细胞生长紧密,羟脯氨酸及DNA含量增高.结论:TGF-β1壳聚糖缓释微球可在体外稳定释放,并具有生物学活性;其运用于P3/4HB无纺支架,可促进细胞增殖和胶原合成,为研究为制备携带壳聚糖TGF-β1缓释微球的组织工程复合支架打下了良好的基础.     

套管法与缝合法在建立小鼠颈部心脏移植模型的比较

目的:比较套管法与缝合法建立小鼠颈部心脏移植模型的优缺点。方法:分别用套管法和缝合法建立小鼠颈部异位心脏移植模型,从供心总缺血时间、手术成功率、手术难度和设备要求、术后血管内膜完整性、并发症发生率、术后生存期及总手术时间来比较。结果:经过25次套管法和39次缝合法实验,各自成功23例、28例,成功率分别是92%、72%;初学者在10倍目镜下就可完成套管吻合,后者要求术者有显微外科基础,至少需借助16倍目镜才能完成;套管法不损伤血管内膜,术后血管通畅性优于缝合法。结论:套管法可缩短供心总缺血时间,简化手术操作,成功率高,术后血管通畅性好,并发症无明显增加,手术时间无明显延长,是初学者建立该模型优先选择的方法。     

去端肽胶原介导小干扰RNA抑制大鼠静脉移植物内膜增生

Objective To evaluate the efficacy of using small interfering RNA targeting TF as a therapy for vein graft failure. Methods External jugular vein to carotid artery interposition vein grafts, which were applied to a low flow condition, were made in 120 Sprague-Dawley rats weighing 260 to 300 g. These rats were randomly divided into 4 groups, 30 rats each group. Group A was atelocollagen-TF Stealth<'TM> Select RNAi group. Group B was atelocollagen-TF Stealth<'TM> RNAi group. Group C was atelocollagen group. Group D was control group. Small interfering RNA mixed with atelocollagen was administrated to the external wall of grafted veins. The TF protein expression of vein gratis was analyzed by Western blot at 1, 3, 7, 14, and 28 d postoperatively, and by immunochemistry at 3 d postoperatively. The proliferation index was determined at 14 d postoperatively. Neointimal hyperplasia was evaluated at 28 d postoperatively. BLOCK-iTTM fluorescent oligo was used to confirm its stability and successful transfer into the vein graft wall at 3 and 7 d postoperatively for another group (n = 12). Results Fluorescence of BLOCK-iT<'TM> fluorescent align could be detected in the graft wall even at 7 d postoperatively. Knockdown of the TF expression was achieved by perivascular application of siRNA using atelocollagen. Compared with control group, the intima thickness at 28 d after grafting was significantly reduced (P ＜ 0.05). This phenomenon was preceded by significant reduction of cell proliferation in siRNA-treated grafts at 14 d postoperatively (P ＜0.05). Conclusion The expression of TF in vein grafts can be effectively inhibited by specific siRNAs using a atelocoilagen-based nonviral delivery approach/n vivo, so that the neointimal thickening can be prevented.     

小婴儿Cantrell五联症I期手术的围术期管理

患儿:女,22 d.孕2产2,孕36周因宫内窘迫行剖宫产,生后发现心脏外露.父25岁,母22岁,兄3岁,体健,无家族遗传病史.体检:体温35℃,呼吸22次/min,脉搏130次/min,血压73/46mm Hg(1 mm Hg=0.133 kPa),体重2.7 kg.     

新生儿和婴儿完全性肺静脉异位引流的外科治疗

2006 年1 月至2011 年5 月我科共手术治疗新生儿和婴儿完全性肺静脉异位引流(total anomalous pulmonary venous connec -tion,TAPVC)23 例,取得了良好效果,现总结报道如下.     

制备壳聚糖微球体外缓释TGF-β1的研究

应用离子交联沉淀法制备壳聚糖-转化生长因子（TGF-β1）缓释微球,研究其体外缓释性能。采用离子交联沉淀法制备壳聚糖微球,以其包裹TGF-β1,制备具有缓释效能的壳聚糖-TGF-β1缓释微球。用扫描电镜、激光粒度分析仪、Elisa法等观察其表面形态,测定药物载药率、包封率、体外缓释效率等指标。结果表明：所得微球球形良好,表面光滑,粒径分布集中,平均粒径272nm。壳聚糖微球有较高的药物包封率,达80.60%。体外释放试验提示,TGF-β1初期存在突释现象,前24h释放达27%,但其后可从壳聚糖微球中稳定释放,7d累计释放达41%。离子交联沉淀法制备壳聚糖缓释微球方法简单易行,所得壳聚糖-TGF-β1微球具有良好的缓释效能,提示其在组织工程领域具有良好的应用前景。     

对抗脑缺血后谷氨酸毒性作用的研究进展

脑缺血损伤级联反应中,兴奋毒性和梗死周围去极化均与谷氨酸(glutamate,Glu)大量释放、重摄取受阻和突触后膜Glu受体过度激活有关。文章综述了近年来研究较多的对抗脑缺血后谷氨酸毒性的方法和药物。     

聚乙二醇交联去细胞瓣构建组织工程瓣膜复合支架

目的 采用分子量20 kDa 的枝化状丙烯酰化聚乙二醇(PEG)交联巯基化去细胞瓣,构建组织工程瓣膜复合支架,并对支架的结构稳定性、力学性能和细胞相容性进行初步检测.方法 取猪新鲜主动脉瓣叶,进行脱细胞瓣处理,制备去细胞瓣并巯基化.戊二醛固定去细胞瓣,PEG 交联巯基化去细胞瓣.形态学观察去细胞及交联效果,差示扫描量热法(DSC)测定热收缩温度,Ⅰ型胶原酶溶液测定其抗酶性分解能力,拉伸实验测定其抗拉强度和弹性模量,并采用AlamarBlue 法测定支架对MRC-5 人胚肺细胞的细胞毒性.结果 HE 染色和扫描电镜(SEM)显示去细胞完全,细胞外基质保存完整;PEG 交联后瓣叶变薄,纤维增粗呈束.PEG 交联瓣的热收缩温度为(75.16 ±0.69)℃,与去细胞瓣[(67.63 ±1.09)℃]相比有显著提高,其差异有统计学意义(P ＜0.05).PEG 交联瓣6 h 及12 h酶性分解率分别为(17.52 ±1.69)%和(48.83 ±2.67)%,与去细胞瓣[(64.91 ±2.05)%和(98.23 ±1.20)%]相比,分解率显著下降.PEG 交联瓣抗拉强度较去细胞瓣显著为高,并达到天然瓣水平,弹性模量则远高于其他各组.细胞毒性试验显示PEG 组和对照组活力细胞差别为(1.82 ±0.03)%,无统计学意义(P ＞0.05).结论 PEG 交联可显著改善去细胞瓣结构稳定性和力学性能,而无明显细胞毒性,有望用于组织工程瓣膜复合支架的构建.     

主动脉瓣膜间质细胞体外诱导钙化的实验研究

目的体外培养、诱导主动脉瓣膜间质细胞钙化,并观察其表型变化。方法使用胶原酶消化法从新鲜猪主动脉瓣膜上分离并体外原代培养主动脉瓣膜间质细胞,行免疫荧光染色细胞鉴定。取4~8代间质细胞,随机分为两组,实验组:以含甘油磷酸、维生素C、地塞米松的钙化培养基进行钙化诱导培养2周;对照组:以标准培养基培养2周。在光学显微镜下行钙化结节计数,茜素红染色观察并半定量检测钙沉积含量;采用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测间质细胞α-平滑肌肌动蛋白(-αSMA)及钙化相关因子(骨钙素、骨桥蛋白、核心结合因子)的基因表达。结果从猪主动脉瓣膜上成功分离并体外培养瓣膜间质细胞,-αSMA及波形蛋白(vimentin)染色阳性,血管性血友病因子(vWF)染色阴性。间质细胞钙化诱导培育2周可成功诱导钙化,自发形成钙化结节,实验组钙化结节(156.25±17.38个/孔vs.2.50±1.29个/孔)和钙沉积(17.52±2.04 vs.1.00±0.22)显著高于对照组(P0.05);实时RT-PCR提示:实验组-αSMA、骨钙素、骨桥蛋白、核心结合因子等表达均较对照组明显升高(P0.05)。结论体外诱导钙化的瓣膜间质细胞呈现相对激活状态,表型向收缩表型和成骨表型转化,可能为瓣膜钙化的病理基础。