人肥大细胞羧肽酶编码区基因的克隆与鉴定

肥大细胞是变态反应发生的重要效应细胞 ,可产生和释放多种参与变态反应的炎性介质 ,其中蛋白酶是一类重要的炎性介质 ,以中性蛋白酶为主 ,约占肥大细胞蛋白总量的5 0 % [1] 。中性蛋白酶主要包括肥大细胞类胰蛋白酶、肥大细胞羧肽酶 (humanmastcellcarboxypeptidase,HMC CP)和     

类糜蛋白酶抑制剂对人大肠肥大细胞类胰蛋白酶释放的影响

目的：研究类糜蛋白酶抑制剂对人大肠肥大细胞释放类胰蛋白酶的影响。方法：人大肠组织经酶消化后，细胞成份有全HBSS重新悬浮。激发过程在LP4试管中、37℃条件下完成。类胰蛋白酶水平用酶联免疫吸附试验（ELISA）方法测定。结果：促分泌剂抗IgE抗体和CI在培养15分钟和35分钟时可明显刺激人大肠肥大细胞类胰蛋白酶的释放，在相同实验体系中，类糜蛋白酶抑制剂ZIGPFM、TPCK和α1-抗胰蛋白酶无明显刺激人大肠肥大细胞释放类胰蛋白酶的作用。类糜蛋白酶抑制剂均可以剂量依赖性的方式抑制抗IgE抗体诱导的类胰蛋白酶的释放，最大浓度的ZIGPFM（1 μmol／ml）、TPCK（80 μmol／ml）和α1-抗胰蛋白酶（30 μmol／ml）可分别抑制37％、40％和36．6％的类胰蛋白酶释放。在37℃条件下同大肠细胞预培养20分钟与无预培养相比，ZIGPFM和TPCK对抗IgE抗体诱导的类胰蛋白酶释放的抑制作用略增强。Amastatin对抗IgE抗体诱导的类胰蛋白酶的释放无作用。类糜蛋白酶抑制剂均可以剂量依赖性的方式抑制CI诱导的类胰蛋白酶的释放，抑制范围在23％-35．3％。在37℃条件下同大肠细胞预培养20分钟与无预培养相比，ZIGPFM对CI诱导的类胰蛋白酶释放的抑制作用有增强，TPCK则无此特点。结论：类糜蛋白酶抑制剂可抑制人大肠肥大细胞IgE依赖性和非依赖性类胰蛋白酶的释放，提示类糜蛋白酶抑制剂可望成为炎症性肠病或其它肥大细胞相关疾病的一个新的治疗途径。     

人肥大细胞类糜蛋白酶基因的原核表达及其多克隆抗体的制备与鉴定

目的:克隆人肥大细胞类糜蛋白酶cDNA,并进行原核表达,制备重组蛋白免疫家兔,制备兔抗类糜蛋白酶多克隆抗体。方法:用RT-PCR技术克隆类糜蛋白酶cDNA,用Gateway技术构建表达载体,以大肠杆菌为宿主,用L-阿拉伯糖诱导重组肥大细胞类糜蛋白酶的表达,经Ni-NTA-Agarose柱层析纯化后,以其为免疫原制备兔抗类糜蛋白酶多抗,并以间接ELISA测定抗体效价,以Westernblot鉴定抗体的特异性。结果:成功地克隆了人肥大细胞类糜蛋白酶cDNA,并在大肠杆菌BL21-AI中表达成功,用纯化的重组类糜蛋白酶为免疫原,免疫家兔制备了兔抗类糜蛋白酶抗体,ELISA结果显示效价达1:12800,Western blot分析表明该抗体能特异结合类糜蛋白酶。结论:以纯化的重组类糜蛋白酶为免疫原,成功地制备了效价及特异性较高的兔抗类糜蛋白酶抗体,为进一步建立简便的类糜蛋白酶检测方法及研究类糜蛋白酶生物学功能奠定了良好的基础。     

葎草及豚草过敏原嵌合基因的创建及其抗原性评价

目的 构建一种嵌合过敏原，同时保有葎草和豚草过敏原的特征，而其抗原性得到改变。方法 以业经克隆到葎草和豚草过敏原基因片段的混合物为模板，利用桥式PCR和重叠引物法，扩增得到嵌合基因，利用测序、蛋白表达及抗原性分析软件对所得嵌合基因编码蛋白与MHCⅡ类分子的结合表位进行评价。结果 通过以上方法获得嵌合基因3例，序列分析表明，3例嵌合基因AL03-1、AL03-2及AD03-4分别与原始克隆LCM9、LCS13（LCM20）及D03具有较高的同源性，而其抗原性分别比相似的原始克隆略强、略强及明显增强，融合表达带型与原始克隆的也基本一致。结论 采用桥式PCR及重叠引物法，嵌合基因及其表达载体得到成功构建，所得的嵌合基因将满足不同体质或不同免疫力的人群、不同免疫治疗阶段的脱敏治疗的临床需要。     

嗜碱性粒细胞激发试验的临床应用

目的观察嗜碱性粒细胞激发试验（BAT）的临床应用情况,为过敏疾病的诊断提供参考。方法选择10种吸人性过敏原对30例过敏性疾病患者行过敏原体外特异性BAT,福克全自动过敏原定量分析系统检测患者血清特异性IgE（sIgE）水平。对BAT与sIgE检测结果进行一致性检验。结果被检10种过敏原中,马上皮、链格孢属、枝孢属霉菌、艾蒿、白桦树及梯牧草BAT的阳性检出率明显高于血清sIgE检测,P均〈0．05。两种检测方法对过敏原检测的整体阳性率分别为23％、12．2％,P〈0．05;两种方法检测结果阳性吻合率最高的过敏原是屋尘螨和粉尘螨,分别为17％和13％,其余过敏原阳性吻合率均低于7％。两种检测方法对10种过敏原的检测结果一致性较差,Kappa均〈0．4。结论BAT对过敏原的检测范围比sIgE检测更宽泛,其不仅能帮助诊断sIgE阳性过敏,亦有可能对sIgE检测结果阴性即非IgE介导的过敏诊断有帮助。     

蛋白酶激活受体2激动剂诱导上皮细胞分泌MCP-1

目的:探讨蛋白酶激活受体(PAR)-2激动剂对人上皮细胞单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)分泌的影响.方法:人肺上皮细胞系A549细胞分别接种于12孔培养板各孔内,并分别用不同浓度的PAR-2激动剂,反PAR-2激动剂进行刺激.刺激时间为2,8和16 h.用ELISA方法检测上清液中的MCP-1水平.结果:经过16 h的培养,PAR-2激动剂SLIGKV和tc-LIGRLO均可引起浓度相关性MCP-1释放增加,tc-LIGRLO引起的最大MCP-1释放量达基础分泌量的13倍.反PAR-2激动剂对MCP-1释放的影响较小.时间相关曲线表明,PAR-2激动剂的作用从2 h开始,16 h达高峰.结论:PAR-2激动剂是高效的人肺上皮细胞MCP-1的促分泌剂.其拮抗剂有可能具有抑制呼吸道炎症的作用.