巴曲酶在实验性分泌性中耳炎中的防治作用

目的 验证巴曲酶（Batroxobin,DF-521）对实验性分泌性中耳炎的防治作用。方法 选用豚鼠,先测声导抗、听性脑干反应（ABR）阈值。麻醉状态下做实验性分泌性中耳炎动物模型,当动物鼓室导抗由A型变为B或C型,动物造模成功。此时,用微量注射器将5μl巴曲酶（1BU DF－521)用0.3ml生理盐水稀释的巴曲酶注射入双侧中耳腔内（DF－521组,8只）;同样将等量地米松（激素组,8只）和生理盐水（生理盐水组,6只）分别注入双侧中耳腔做为对照,一周后,再测动物 导抗,ABR瓶值。取中耳标本进行形态学和中耳粘膜纤维连接蛋白免疫组织化学检查。结果 DF－521组动物鼓室导抗图由B型变为A或C型比例高于激素组和生理盐水组,形态学检查,三组中耳标本比较,DF－521组中耳粘膜炎性反应最轻,免疫组化示中耳粘膜纤维连接蛋白在DF－521组表达最低。结论 DF－521可治疗分泌性中耳炎,且能有效地预防其发展为粘连性中耳炎,是一种较激素为好的临床用药。     

强噪声暴露后耳蜗毛细胞的病理形态变化

目的观察强噪声暴露后,耳蜗毛细胞的纤毛、胞体、及胞核的损伤情况。方法听力正常豚鼠,体重在250～300g之间,经强度为170dB SPL的脉冲噪声暴震200次后,取材作全耳蜗铺片行免疫组化检测（prestin和phalloidin）;扫描电镜及透射电镜,观察受损毛细胞的病理变化。同时做毛细胞的纤毛、胞体及胞核的标记染色。荧光显傲镜和电镜下观测结果：结果强噪声暴露后,毛细胞纤毛大部分消失,只有小部分表皮板存在,同时细胞核蹿裂消失,而此时胞体大部分存在,但有肿胀及变形等变化。结论噪声损伤后,毛细胞的纤毛及胞核首先发生变化,随后胞体肿胀溶解,因此毛细胞的胞核及纤毛变化最先反映毛细胞受损情况,但纤毛的缺失并不代表毛细胞的缺失和死亡。如果单从一种形态观测指标评估毛细胞的损伤病理状况是不全面的。     

Math1基因内耳导入后噪声性聋豚鼠听功能改变观察

目的观察Math1基因内耳导入对噪声性聋豚鼠听功能的影响,探讨Math1基因过表达对噪声损伤耳蜗的生物学效应,为内耳基因治疗提供实验基础和理论依据。方法经脉冲噪声致聋的豚鼠45只（各频率ABR阈值均≥95dB SPL）,雌雄不限,实验开始时体草250～300g。随机分为3组：Ad—Math1-EGFP组（30只）;Ad—EGFP组（5只）;空白组（10只）。各组豚鼠在基因转导后4周、8周分别测试双耳ABR。测试完毕后处死动物,观察听泡及耳蜗尤炎性病变者记录听阈结果。结果Math1导入后4周,导入耳各频率ABR阈值低于对照耳（右耳）,也低于Ad—EGFP组及空内组,平均达到85dBSPL。Math1导入后8周,导入耳各频率ABR阂值低于对照耳（右耳）,也低于Ad—EGFP组及空白组,与4周时比较,进一步好转,平均达到75dB SPL。结论Math1基因内耳导入可使噪声导致全聋的豚鼠听功能部分恢复,为噪声性聋的治疗打开了新的思路和手段。     

腺病毒携带EGFP基因经完整圆窗膜转导豚鼠耳蜗的实验研究

目的研究腺病毒携带目的基因经完整圆窗膜途径耳蜗转导的可行性及安全性，为内耳基因治疗提供实验基础和理论依据。方法20只白色红目豚鼠，术前及术后分别行听性脑干反应（ABR）检查。实验组（12只）以重组腺病毒携带的增强型绿色荧光蛋白基因（enhancedgreenfluorescentprotein，EGFP），对照组（8只）以人工外淋巴液注入豚鼠圆窗龛内。分别于术后5天、14天取双侧耳蜗标本做基底膜铺片，耳蜗冰冻切片观察。结果于圆窗龛内注入腺病毒携带目的基因的转导方法对听力无明显影响。转染耳蜗及对侧耳蜗内目的基因呈广泛表达。5天组表达产物最高，14天组逐渐降低。对照组耳蜗未见EPFP表达。结论于圆窗龛内注入腺病毒携带目的基因转导的方法对耳蜗无明显毒害作用，且能够将目的基因成功转导至双侧耳蜗组织并广泛表达。     

维生素C对豚鼠噪声性听力损失的预防作用

目的 研究维生素C对噪声性听力损失是否具有预防作用。方法 40只雄性花色豚鼠随机分为5组，每组8只。其中3组接受噪声暴露，分别腹腔注射生理盐水、维生素C(10．0，50．0mg／kg)；另2组无噪声暴露，分别腹腔注射生理盐水、维生素C(50．0mg／kg)。比较噪声暴露后各组豚鼠听觉脑干反应(ABR)的阈移，评价维生素C对噪声性听力损失的预防作用。结果腹腔注射10．0，50．0mg／kg维生素C可在一定程度上减少噪声对豚鼠引起的ABR阈值增高。结论 维生素C具有一定的预防噪声性听力损失的作用。     

脉冲噪声暴露后大鼠耳蜗外毛细胞死亡的启动方式

目的:观察强脉冲噪声暴露后大鼠耳蜗毛细胞死亡的启动方式。方法:将大鼠暴露于平均压力峰值级为154 dB SPL的脉冲噪声100发,分别于噪声暴露后10 m in,3 h,6 h解剖取耳蜗,应用细胞核DNA染料碘化丙锭(prop id ium lod ide,PI)标记耳蜗基底膜细胞,荧光显微镜下观察毛细胞核形态学变化。结果:强脉冲噪声暴露后10 m in可见到核固缩的外毛细胞,3 h出现少量核肿胀和核缺失外毛细胞,6 h可见到外毛细胞核大片段缺失。结论:毛细胞凋亡发生于脉冲噪声暴露后即刻,坏死出现于凋亡之后。细胞凋亡过程迅速,噪声暴露后6 h耳蜗基底膜外毛细胞核的缺失主要源于凋亡细胞。     

Math1基因导入成年大鼠前庭有效途径的探索

目的探索Math1基因导人大鼠前庭简便有效的方法和途径,为前庭功能障碍基因治疗的相关研究提供参考。方法将20只成年Wistar大鼠分为缺失E1、E3基因片段且构建有Math1基因和增强型绿色荧光蛋白报告基凶的复制缺陷型腺病毒（adnovirus—Math1—enhanced green fluorescence protein,Ad—Math1—EGFP）鼓阶导入组和前庭阶导人组．Ad—Math1—EGFP导入组大鼠在右耳通过耳蜗底转鼓阶或前庭阶打孔的方法导人物理滴度为2．1×1011v．p／ml的上述腺病毒5μl。在导入3天、7天后分别将动物处死,进行GFP表达观察。结果导入Ad—Mathl—EGFP3天后,前庭阶导入组大鼠的前庭终末器官及耳蜗均出现明显的GFP阳性表达;而鼓阶导入组的表达则局限于耳蜗,7天后仍未见前庭终末器官的GFP阳性表达。结论耳蜗底转前庭阶打孔可以作为Math1基因导入大鼠前庭简便有效的途径。     

Smad5基因在小鼠耳蜗中的表达及定位

目的 了解Smad5基因在小鼠耳蜗中的表达及定位。方法 应用RT-PCR检测Smad5基因的表达,用原位杂交法检测耳蜗中Smad5 mRNA的表达部位,用免疫组织化学方法确定Smad5蛋白在耳蜗中的定位。结果 Smad5基因在小鼠耳蜗中有高表达,表达部位在毛细胞、螺旋神经节细胞、支持细胞、血管纹、基底膜等。结论 Smad5在耳蜗中存在,是耳蜗中众多蛋白中的一种。它可能在耳蜗的形成、毛细胞的分化过程中起着重要的作用。     

大鼠耳蜗大上皮嵴细胞体外培养的实验观察

目的建立大鼠耳蜗大上皮嵴（greater epithelial ridge，GER）细胞体外培养体系，探讨其在离体培养条件下的生物学特性、生长模式及超微结构。方法取生后1d大鼠耳蜗，利用机械分离和酶消化相结合的方法分离出纯GER细胞，分别于无血清和含10％胎牛血清的DMEM培基中进行培养，观察细胞生长特性，并对培养物进行溴脱氧尿苷（BrdU）、鬼笔环肽（phalloidin）、Z01、钙视网膜蛋白（calretinin）及肌球蛋白VIIa（myosin VIIa）免疫组化鉴定及扫描电镜观察。结果GER体外培养细胞呈现典型的上皮样多角形外观，细胞间连接紧密，具有明显的增殖能力，在含血清培养基中易形成贴壁细胞岛，而在无血清培养条件下则易形成悬浮细胞球。GER细胞呈现BrdU、phalloidin以及Z01染色的阳性反应，而calretinin及myosinVIIa则表现为阴性。扫描电镜显示GER细胞表面可见微绒毛和中心体，但未见毛细胞特异性结构纤毛束。结论GER体外培养细胞具有增殖能力，在不同培养条件下可分别呈现贴壁细胞岛及悬浮细胞球生长特性，GER细胞表达上皮细胞来源标记物，但不表达毛细胞特异性标记物。     

p27Kip1在不同时期大鼠耳蜗大上皮嵴的表达

目的观察p27Kip1在不同时期大鼠耳蜗的大上皮嵴中的表达情况,探讨p27Kip1在毛细胞分化和再生过程中的作用.方法对胚胎期12天、13天、14天、16天、18天、20天和出生后当天、2天、5天、7天、10天、14天等12个年龄段的大鼠耳蜗进行冰冻切片,然后以1:100抗p27Kip1小鼠单克隆抗体为一抗,1:200异硫氰酸荧光素标记山羊抗小鼠IgG为二抗,进行免疫荧光组织化学检查.结果①胚胎期14天时,p27Kip1开始在蜗管表达,其表达限于原始柯蒂氏器.原始柯蒂氏器中全部细胞均着色.②胚胎期20天左右时,p27Kip1开始在大上皮嵴细胞表达,而在毛细胞中停止表达,但在支持细胞中仍有表达.③出生后7天时,p27Kip1在大上皮嵴的表达达到最强,之后其表达减弱,直至出生后2周时大上皮嵴结构消失.④p27Kip1在耳蜗发育成熟后仍在支持细胞中表达.结论p27Kip1可以作为听感觉上皮的一个标记物.p27Kip1在大上皮嵴细胞中表达,对正常数目毛细胞的产生和耳蜗嵌合体的形成有重要作用.p27Kip1在支持细胞中长期表达是哺乳类毛细胞不能再生的原因之一.