新生大鼠耳蜗基底膜上皮细胞层的分离：酶消化与机械解剖可否使分离部分细胞失去活性

目的：探讨利用酶消化和机械解剖相结合方法分离新生大鼠耳蜗上皮细胞层的方法。方法：实验于2003-02／06在解放军总医院耳鼻咽喉科研究所进行。取新出生SD大鼠耳蜗基底膜后，将其放人含有嗜热菌蛋白酶的D．Hank溶液中，37℃孵箱孵育25min进行酶消化，然后在高倍显微镜下应用自制的超细钨丝刀进行显微机械分离。对分离的耳蜗上皮细胞层进行半薄切片硼砂甲苯胺蓝染色与耳蜗冰冻切片苏木精一伊红染色进行形态对比。结果：①分离后的耳蜗基底膜上皮层在显微镜下呈透明的薄片样组织，其内的各种细胞形态保持完好。②硼砂甲苯胺蓝染色与苏木精一伊红染色进行形态比较发现，分离的耳蜗基底膜上皮层只含有基底膜上的上皮组织，包括耳蜗感觉上皮和非感觉上皮，即只有内毛细胞、外毛细胞、小上皮嵴、大上皮嵴和支持细胞，是纯净的上皮组织而没有任何的结缔组织。结论：利用37℃和25min时间的酶消化法及机械解剖相结合的实验技术可以分离出纯粹的耳蜗上皮细胞层，为进一步纯化上皮内的各种细胞，进行各种基因转染试验以及耳蜗内的各种基础实验建立细胞模型并提供有效地实验手段。     

α-受体阻滞剂对老化大鼠耳石保护作用的扫描电镜观察

目的　应用扫描电镜观察老化大鼠及α 受体阻滞剂 (络斯宝 )处理后耳石的变化。方法　Wistar雄性大鼠 15只分为正常对照组 (n =5 )、老化组 (n =5 )、老化 +洛斯宝组 (n =5 )。老化造模完成后 ,分别进行扫描电镜观察。结果　正常大鼠的耳石形态正常 ;老化大鼠耳内可见线团样耳石融合、变平 ,有巨大耳石出现 ,可见球形和异形耳石 ,在移行细胞区 ,可见较多的耳石吞噬现象 ,球囊斑见小片状纤毛缺失 ;洛斯宝处理组可见球形耳石 ,有粘结现象 ,但一般均为光滑形态或绒线团外观 ,未见巨型耳石 ,移行区耳石数量较老化组少。结论　老化大鼠耳石出现明显异常 ,α 受体阻滞剂 (洛斯宝 )对耳石器有一定的保护作用     

抗生素89－07与奈替米星对豚鼠耳毒性的比较

９２只豚鼠分别肌注４种剂量的抗生素８９－０７、ＮＴＬ及生理盐水，２８ｄ后通过电生理、病理形态学检查，比较抗生素８９－０７与ＮＴＬ对豚鼠的耳毒性。结果显示：抗生素８９—０７与ＮＴＬ对听性脑干电反应阈值无显著影响。抗生素８９－０７较ＮＴＬ对前庭功能影响稍轻。耳蜗病变从扫描电镜、耳蜗铺片所见抗生素８９－０７较ＮＴＬ轻。内耳切片观察两药无显著区别．前庭病变各剂量总体相比抗生素８９－０７较ＮＴＬ轻。     

水杨酸钠引起耳鸣大鼠听皮层突触形态改变的透射电镜观察

目的用透射电镜观察水杨酸钠引起耳鸣大鼠听皮层突触形态的变化。方法成年健康雄性白色Wistar大鼠32只,随机平分为2组。第一组腹腔注射水杨酸钠350mg/kg,第二组腹腔注射等量生理盐水,均在每天上午9点注射,持续30天。两组所处饲养环境（包括环境噪声、12小时昼夜节律、饮食等）完全相同。1月后快速处死,取双侧听皮层组织进行透射电镜观察。结果与对照组相比,水杨酸组突触数量明显增加,许多突触形态由平型变成凹型或U型,突触界面曲率增加,突触面积增大,活性区增加,每一活性区的长度增加,突触间隙明显增宽,突触后膜致密物质厚度增加。U型突触直径平均为（1.7±0.23）μm,平直型突触直径平均为（0.53±0.14）μm,二者比较有显著性差异（P〈0.05）。结论水杨酸钠能够引起听皮层突触形态的改变,这种改变与长时程增强现象（Long-term potentiation,LTP）非常相似,有可能是耳鸣与突触可塑性以及与学习记忆相关的有力证据,值得深入研究。     

阳离子脂质体介导BFGF/GFP基因对药物性耳蜗损害的防治作用

目的 探讨阳离子脂质体(天然碱性脂SA)携带碱性成纤维细胞生长因子/绿色荧光蛋白(bFGF/GFP)基因在豚鼠耳蜗中的表达,以及对庆大霉素所致耳蜗损害的防治作用。方法 将36只豚鼠分为3组,预防组右耳园窗注入SA-bFGF/GFP复合物后次日肌肉注射庆大霉素150mg.Kg~(-1).d~(-1)8天,治疗组先用庆大霉素8d后次日右耳给药,对照组单用庆大霉素8d。分别于实验前后及处死前行听觉脑干诱发电位(ABR)测试。荧光显微镜下观察耳蜗GFP的表达;用耳蜗琥珀酸脱氢酶染色铺片,扫描电镜观察毛细胞的缺失情况。结果 荧光显微镜下见双侧耳蜗均有GFP表达。预防和治疗组处死前的双耳ABR阈值与对照组比较差异有显著意义(P<0.01,P<0.05),耳蜗内外毛细胞缺失数与对照组比较差异有显著意义(P<0.01,P<0.05)。结论 SA脂质体介导的bFGF/GFP基因单耳给药双侧耳蜗均有高效表达,并对庆大霉素所致的耳蜗损害有防治作用。     

bFGF-Math1基因诱导UEC-4细胞产生毛细胞的实验研究

目的进一步探讨bFGF-Math1基因在前庭上皮细胞系(UEC-4)细胞中的表达及生物学作用.方法利用阳离子脂质体LipofectamineTM2000介导bFGF-Math1基因真核表达质粒(pCI-bFGF-Math1)转染UEC-4细胞,利用RT-PCR技术检测基因在细胞中的表达,并利用免疫组织化学方法观察细胞的分化及特异性抗体的表达.结果脂质体介导的基因可在细胞内获得良好的表达,转染后24h,相差显微镜下观察细胞形态发生变化,免疫组织化学显示转染后细胞可以表达毛细胞特异性蛋白Myosin7a.结论bFGF-Math1基因有良好的生物学特性,可以有效地诱导支持细胞向毛细胞样细胞转变.     

脉冲噪声暴露后早期大鼠耳蜗外毛细胞死亡时程观察

目的观察强脉冲噪声暴露后早期大鼠耳蜗毛细胞损伤发展的规律。方法将大鼠暴露于平均压力峰值级为154dB SPL的脉冲噪声100发，分别于噪声暴露后10min、30min、3h、6h解剖取耳蜗，应用碘化丙锭（PI）标记耳蜗基底膜，荧光显微镜下观察脉冲噪声暴露后耳蜗毛细胞凋亡和坏死的时程特点。结果强脉冲噪声暴露后10min出现外毛细胞核染色质移位及凋亡小体，30min可见到少量肿胀的外毛细胞核，3h观察到少量外毛细胞核的缺失。6h耳蜗基底膜损伤区出现大片外毛细胞核缺失和部分微小球形固缩的外毛细胞核。结论耳蜗外毛细胞死亡发生于强脉冲噪声暴露后即刻，外毛细胞凋亡先于坏死。细胞凋亡过程迅速，强脉冲噪声暴露后6h耳蜗基底膜损伤区大部分死亡细胞已被清除。     

Smad5 基因在小鼠耳蜗胚胎发育中的作用

目的检测Smad5基因在小鼠耳蜗胚胎发育中的作用。方法选用耳廓反应灵敏、健康的C57BL／6小鼠作为种鼠交配．用观察阴栓方法获得胚胎9天到20天的胎鼠，≤17天取胚胎头，≥18天在显微镜下取耳蜗，胚胎头水平冰冻切片，耳蜗平行于蜗轴冰冻切片，HE染色方法观察小鼠内耳发育形态演变过程，免疫组织化学方法检测Smad5蛋白在小鼠胚胎10～20天的表达情况。结果胚胎10天，听泡发育，胚胎12天听泡下部有蜗管始基形成并开始发育。胚胎18天，蜗管发育了2圈，形成了可以辨认的内、外毛细胞，血管纹开始分化。Smad5在小鼠内耳胚胎发育全程均有阳性表达，且表达比较广泛，尤其早期在整个听囊均有表达。在胚胎15～17天．主要集中在即将发育成基底膜听觉感受器的部分。在胚胎发育中后期在内外毛细胞、螺旋神经节细胞、支持细胞、血管纹、基底膜、前庭膜等也有表达。结论Smad5参与小鼠耳蜗胚胎发育全过程，它可能为听觉的发生所必需的基因。     

强脉冲噪声暴露豚鼠耳蜗传出神经乙酰胆碱酯酶(AChE)活性的定量分析

目的强脉冲噪声暴露后,豚鼠耳蜗听神经复合动作电位(Cochlear action potential,CAP)阀值提高,按不同的阈移分为五组:0~5 dB(6只);10~15 dB(5只);20~25 dB(11只);30~35 dB(7只);55~60 dB(5只)以及正常对照组6只豚鼠。方法用Image-pro plus图象分析软件,人机交互对话方式对各组耳蜗铺片观察耳蜗传出神经末梢处病变的长度、传出神经末梢数目以及乙酰胆碱酯酶(AChE)活性(以灰度表示)进行测量。结果不同阈移组间耳蜗病变长度差异均有显著性或极显著性;各实验组耳蜗传出神经末梢计数随阈移增大而减少,与对照组相比差异均有显著性;AChE灰度值变化多集中在第二圈,第二圈传出神经末梢个数与该圈AChE活性呈正相关(r=+0.75);第二圈AChE灰度值变化与CAP阈移相关,即CAP阈移愈大,AChE灰度值愈大(活性降低),反之亦然。结论生理的变化与形态学计量的变化是相一致的。     

腹侧听泡外入路小鼠耳蜗鼓阶基因导入的实验研究

目的研究腺病毒携带目的基因经腹侧听泡外入路转导耳蜗鼓阶底转的可行性及目的基因的表达特点,为内耳基因治疗提供实验基础和理论依据。方法16只健康5周龄C57BL/6J小鼠,腺病毒组10只,以重组腺病毒携带有Hath-1和增强型绿色荧光蛋白基因（enhanced green fluorescent protein,EGFP）,人工外淋巴液组6只以人工外淋巴液,经腹侧听泡外入路导入耳蜗鼓阶底转。分别于术后第7天分别行听性脑干反应（ABR）检查后取双侧耳蜗标本做基底膜铺片、耳蜗冰冻切片观察基因的表达。结果经腹侧听泡外入路转导耳蜗鼓阶底转的转导方法对听力影响较小。腺病毒组耳蜗内目的基因呈广泛表达。对照组耳蜗未见荧光表达。结论经腹侧听泡外入路转导耳蜗鼓阶底转的转导方法对听力影响较小,且能够将目的基因成功转导至耳蜗组织并广泛表达。